Luz 3D eficiente

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 170 (2023) Citar este artículo

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La capacidad de obtener imágenes de muestras de tejido humano en 3D, con resolución celular y un gran campo de visión (FOV), puede mejorar las investigaciones fundamentales y clínicas. Aquí, demostramos la viabilidad de la proyección de imagen de hoja de luz de muestras de cáncer de próstata fijadas en formalina (FFPE) de tamaño de ~ 5 cm3 de cerebro humano fijado en formalina y de hasta ~ 7 cm3 de tamaño, procesadas con el protocolo FFPE-MASH. Presentamos un prototipo de microscopía de hoja de luz, el microscopio de iluminación de plano selectivo de vista dual de tejido aclarado (ct-dSPIM), capaz de adquisiciones rápidas en 3D de alta resolución de tejido aclarado a escala cm3. Utilizamos escaneos de mosaico para obtener vistas generales rápidas en 3D de muestras de tejido completo o vistas generales de mayor resolución de ROI grandes con varias velocidades: (a) Mosaico 16 (resolución isotrópica de 16,4 µm, ~1,7 h/cm3), (b) Mosaico 4 (resolución isotrópica de 4,1 µm resolución, ~ 5 h/cm3) y (c) Mosaico 0,5 (0,5 µm de resolución casi isotrópica, ~15,8 h/cm3). Pudimos visualizar capas corticales y neuronas alrededor del borde de las áreas cerebrales humanas V1 y V2, y pudimos demostrar una calidad de imagen adecuada para la calificación de puntuación de Gleason en muestras gruesas de cáncer de próstata. Mostramos que las imágenes ct-dSPIM son una técnica excelente para evaluar cuantitativamente muestras de tejido humano a gran escala preparadas con MASH en 3D, con un potencial clínico futuro considerable.

A pesar de las claras ventajas de las visualizaciones de microestructuras a gran escala, las muestras de tejido en la investigación fundamental y la patología clínica todavía se examinan principalmente con microscopios de luz convencionales en secciones de tejido delgadas como papel (que van desde aproximadamente 5 a 100 µm), montadas en portaobjetos de vidrio. Esto destruye la estructura del órgano 3D y proporciona solo información 2D limitada sobre un pequeño campo de visión (FoV). Por lo tanto, se necesitan avances significativos hacia nuevos enfoques de microscopía multiescala 3D de alta velocidad y gran volumen con suficiente resolución. Esto permitirá la detección de detalles cruciales y características generales en todas las muestras de tejido grandes (que van desde mm a cm).

La compleja estructura 3D del cerebro humano es inherentemente multiescala y consta de estructuras muy pequeñas que se extienden a lo largo de grandes distancias, incluso áreas cerebrales enteras1. La citoarquitectura cortical en capas, por ejemplo, se define por la densidad celular, el tamaño y la morfología a escala microscópica, pero sus capas se extienden sobre áreas corticales enteras y, por lo tanto, la estratificación se produce en escalas de centímetros. Para permitir la caracterización cuantitativa, como el recuento de células, a lo largo de varias capas e incluso áreas cerebrales completas, se deben realizar tanto escaneos generales de FoV grandes como imágenes celulares de alta resolución. Este tipo de datos es esencial, por ejemplo, para el modelado neuronal realista biológicamente informado2. Por lo tanto, la investigación de la citoarquitectura en capas requiere imágenes de alta resolución y campos de visión grandes.

En el cáncer de próstata, los tumores se caracterizan por ser multifocales y de morfología heterogénea con diversos patrones histomorfológicos en 3D, a lo largo de volúmenes extensos3,4. Hasta la fecha, un diagnóstico definitivo de cáncer de próstata requiere la verificación histopatológica de las biopsias con base en la calificación Gleason Score3. Esto es un desafío, como lo demuestra la variabilidad entre observadores, que a su vez puede conducir a un tratamiento insuficiente o excesivo de los pacientes4. Además, los criterios de "vigilancia activa" están determinados por la cuantificación de la extensión del tumor y el grado de Gleason5. Dado que rara vez se realizan cortes seriados completos de núcleos de biopsias de próstata, podría ocurrir una subclasificación en casos con múltiples focos pequeños de adenocarcinoma de próstata, porque están presentes en diferentes niveles en los bloques de parafina5. Además, pueden producirse biopsias falsas negativas a partir del corte incompleto de bloques de tejido. Por ejemplo, Paulk et al. demuestran la aparición del carcinoma de próstata en las secciones más profundas de los bloques de parafina que estaba ausente en las secciones iniciales de H&E5. En la práctica actual, es posible que no sea posible cortar rutinariamente los bloques completos de parafina para aumentar la visualización del tejido debido a la mayor carga de trabajo y al precio más alto, en comparación con el procedimiento estándar de seccionar solo 3 o 4 niveles.

En los últimos años, la microscopía de fluorescencia de hoja de luz (LSFM), junto con la limpieza óptica de tejidos, se ha utilizado para la visualización en 3D y el examen de tejidos humanos y de roedores con una resolución de mesoescala a microescala6,7,8,9,10,11. Varios laboratorios han desarrollado protocolos de limpieza óptica, como CLARITY6,8, iDISCO9,10 y CUBIC12, que se han aplicado principalmente para volver transparentes los cerebros de los ratones, con el fin de comprender tanto la estructura como la patología del cerebro7. Sin embargo, la aplicación de imágenes de lámina de luz de tejido limpiado a muestras de cerebro humano adulto de archivo grande (es decir, fijadas con fijadores de aldehído), en particular, ha sido un gran desafío debido al tamaño de la muestra y las dificultades de aplicar la limpieza, el etiquetado y la formación de imágenes. en grandes volúmenes de tejido rico en mielina13.

Trabajos anteriores han demostrado el éxito de la limpieza, el etiquetado y la obtención de imágenes de LSFM tanto en cerebro humano7,12,13,14,15,16 como en biopsias de cáncer de próstata humano17. Sin embargo, aunque las muestras de cerebro humano entre 1 mm313 y 1 cm312 y losas de tejido de 1,5 cm de espesor14 se aclararon y etiquetaron con éxito, el tamaño real de la muestra LSFM se ha restringido a 1 mm3, 15 o 500 µm de espesor de losas de tejido13 con un volumen máximo informado de ~ 10,5 mm × 14,1 mm × 3 mm16. Zhao et al. obtuvo imágenes de la muestra de cerebro humano marcada y limpiada ópticamente más grande hasta la fecha (7,5 × 5 × 0,4 cm) con microscopía confocal. Sin embargo, una configuración de microscopía de hoja de luz aumentaría en gran medida la velocidad y la escalabilidad de la adquisición de imágenes. Recientes estudios de próstata, como el descrito y realizado por Glaser et al.17. se centró principalmente en biopsias con aguja gruesa de 1 a 2,5 mm. En la Tabla 1 se incluye una descripción general de las configuraciones de LSFM más destacadas aplicadas a muestras de cáncer de próstata y cerebro humano (y otros tipos de muestras), incluido el volumen y la resolución de la muestra. Tanto el laboratorio Liu17 como el laboratorio Shroff18 han montado objetivos de inmersión múltiple para la obtención de imágenes de tejido limpio en su LSFM de techo abierto y la microscopía de iluminación de plano selectivo invertida dual (diSPIM), respectivamente, para permitir la obtención de imágenes de tejido limpio de, por ejemplo, muestras de próstata humana y cerebro de ratón. Aunque esto muestra que la tecnología LSFM y los protocolos de limpieza están evolucionando rápidamente, hasta ahora ha permanecido fuera del alcance la obtención de imágenes rápidas de tejido limpio en 3D de muestras de próstata humana y cerebro humano a gran escala de muchos centímetros de tamaño lateral y muchos cm3 de volumen.

En este trabajo demostramos que limpiamos ópticamente, etiquetamos y creamos imágenes de varios centímetros cúbicos de muestras de tejido de cerebro humano y cáncer de próstata (secciones axiales de montaje completo). Anteriormente, presentamos MASH (Multiscale Architectonic Staining of Human Cortex), un enfoque escalable de limpieza y etiquetado que demostró ser efectivo para placas de hasta 5 mm de espesor de tejido cerebral humano adulto de archivo. Aquí procesamos muestras de cerebro humano con limpieza y etiquetado MASH. Además, presentamos FFPE-MASH y, por primera vez, procesamos con éxito muestras de próstata humana FFPE. A continuación, presentamos el microscopio de iluminación de plano selectivo de vista dual de tejido limpio (ct-dSPIM) para realizar imágenes 3D LSFM de tejido limpio grandes y eficientes, que supera con creces los estudios de muestras de próstata y cerebro humano LSFM limpios existentes en volumen de imágenes.

Nuestro nuevo enfoque permite la obtención de imágenes en 3D, la visualización y la cuantificación de grandes volúmenes con alta velocidad y una compensación de resolución de velocidad ajustable. Para mostrar la viabilidad de este método, describimos imágenes LSFM del cerebro humano y la próstata. Usamos el ct-dSPIM para obtener imágenes del cerebro humano (lóbulo occipital) hasta ~50 × 35 × 3 mm (>5 cm3) y muestras de resecciones de cáncer de próstata humano (la sección de montaje completo axial después de la prostatectomía) hasta ~40 × 35 × 5 mm (~7 cm3). Las imágenes ct-dSPIM permiten la extensión de los métodos y estudios actuales y permiten el examen de secciones de próstata de montaje completo axial de varios mm de espesor. La aplicación de imágenes ct-dSPIM a muestras más grandes de cáncer de próstata permite nuevos conocimientos en 3D sobre la morfología del tejido tanto benigno como neoplásico. Este conocimiento adicional en 3D sobre los tumores puede mejorar la visualización del tejido a lo largo del bloque, conducir a una mejor comprensión de la arquitectura del adenocarcinoma de próstata y posiblemente mejorar el diagnóstico del cáncer de próstata.

Hemos realizado imágenes 3D multiescala en cerebro humano preparado con MASH (Figs. 1–5) y las secciones axiales de próstata de montaje completo (Figs. 6, 7; Figs. complementarias 1, 2) con un FoV grande con Mosaic 4 y Mosaic 16 adquisiciones y un FoV moderado y de alta resolución para una región de interés específica. El mosaico 16 de muestras de cerebro humano (Figs. 1, 2, 4) permitió exploraciones generales de un bloque de tejido completo a una velocidad relativamente alta (aprox. 8-16 h, ~1,7 cm3/h, 16,4 µm isotrópico, Tabla 2). a 5 cm × 3 cm de tamaño lateral y 3 mm de espesor. Se tomaron imágenes de ROI más pequeñas de las muestras de cerebro humano con un Mosaic 4 (Figs. 3, 4). y mosaico 0.5. (Figura 5). Presentamos y discutimos estos resultados a su vez.

a Muestra tomada aprox. 6 mm anterior al polo occipital (tercera sección de 3 mm de espesor en dirección posterior a anterior). De izquierda a derecha: muestra sin teñir fijada en formalina y muestra teñida con MASH-NR del lado posterior y anterior; muestra clara con imagen del lado posterior (la forma muestra las características de la muestra transparente tanto en el lado anterior como en el posterior; cuadrícula: cuadrados más pequeños 1 × 1 mm, cuadrados en negrita 10 × 10 mm). Reconstrucción 3D de todo el corte a una resolución isotrópica de 16,4 µm con una adquisición Mosaic 16 (barra de escala: 1 cm): las capas ricas en células densamente teñidas son reconocibles incluso con vistas generales de FOV de bajo aumento/gran tamaño (puntas de flecha blancas). El borde V1/V2 se indica mediante flechas negras en la vista general y el ROI ampliado. b Corte anterior consecutivo del mismo lóbulo occipital aprox. 9 mm anterior al polo occipital, paneles como se describe para (a).

Representación 3D y planos ortogonales de datos isotrópicos de 16,4 µm. Vistas ortogonales de MIP de 50 μm (XY: verde, XZ: rojo, YZ: azul) de toda la muestra de 3 mm de espesor. Barras de escala: 5 mm para XZ, YZ y representación de volumen respectivamente y 2,5 mm para el plano XY.

Representación 3D de una adquisición de Mosaic 4 de un ROI en las proximidades de la corteza visual primaria humana (arriba a la izquierda). Las vistas ortogonales de MIP de 50 µm (XY: azul, XZ: verde, YZ: rojo) muestran capas corticales independientes de la orientación (flechas blancas). Los bordes dentados en la vista XZ resultan de la corrección cuando el borde de la adquisición está dentro del tejido. Los ROI ampliados del MIP (XY: amarillo, XZ: magenta, YZ: cian) demuestran cualitativamente la resolución muestreada isotrópicamente y la calidad de imagen y etiquetado en lo profundo de la muestra. Barras de escala: representación de volumen, plano XY e YZ de 3 mm; XZ: 1,5 mm; ROI ampliados 0,5 mm, respectivamente.

Los datos adquiridos de todo el corte del lóbulo occipital (tercera sección de 3 mm de espesor desde el polo occipital hacia la dirección anterior) se muestran con una resolución de 16,4 µm (volumen de 16,4 µm; lado izquierdo). Se tomaron imágenes de dos circunvoluciones con una resolución de 4,1 µm (azul) y en el volumen de 0,5 µm (rojo) con una resolución anisotrópica, con un tamaño de píxel de 0,725 µm × 0,5127 µm × 0,5127 µm. Las inserciones ampliadas demuestran la resolución efectiva que se puede lograr con el volumen de 4,1 µm (magenta) y el volumen de 0,5 µm (naranja), respectivamente. Si bien el volumen de 4,1 µm muestra estructuras mesoscópicas indicativas de minicolumnas (resaltadas en magenta), puede ser difícil diferenciar células individuales más pequeñas de grupos de células con esta resolución en la corteza visual koniocelular extremadamente densamente poblada. El volumen de 0,5 µm permite la identificación de células individuales, incluidas las partes proximales de las dendritas apicales y basales (flechas blancas). Barras de escala: 5 mm (volumen de 16,4 µm), 3 mm (volumen de 4,1 µm) y 0,25 mm (volumen de 4,1 µm, panel ampliado), 1 mm (volumen de 0,5 µm) y 0,075 mm (volumen de 0,5 µm, panel ampliado).

una representación de volumen del conjunto de datos utilizado para el conteo de celdas. b Resultados de la segmentación manual de capas para todo el volumen. Los colores son los siguientes: capa I cian, capa II rojo brillante, capa IIIa naranja, capa IIIb verde, capa IV magenta, capa V azul, capa VI rojo oscuro y materia blanca en amarillo. El tejido de la parte no segmentada del volumen estaba dañado y no permitía la segmentación de capas y se excluyó del análisis. Plano único (plano XY del volumen de la imagen recortada) de los datos filtrados (c) y objetos segmentados automáticamente (d). Las celdas segmentadas se muestran en colores aleatorios. e Estimaciones de densidad de celdas derivadas del recuento total de todas las celdas segmentadas por segmento de capa en todo el volumen de la imagen (para múltiples segmentos no conectados de las mismas capas, los recuentos se agruparon). Colores como se indica para (b). Las barras de escala para todas las imágenes en el extremo izquierdo son de 500 µm y para los dos paneles ampliados de 75 µm.

Las muestras se muestran en varias etapas durante la tubería de procesamiento en el lado izquierdo: después de la desparafinización y el blanqueo (a, e), después de la tinción (b, f) y después de la coincidencia de RI (es decir, aclarado, c, g). En el lado derecho, un MIP del conjunto de datos de Mosaic 16 durante aprox. 50 µm se muestran en escala de grises invertida (d, h). Los círculos rojos indican las regiones cancerosas (identificadas por un patólogo). Abreviaturas: estroma fibromuscular anterior AFS, zona central CZ, uretra U (prostática), zona periférica PZ, zona de transición TZ. Barras de escala: 3 mm.

La muestra de la Fig. 8e-h se muestra aquí en 2D (a, una capa a lo largo de la superficie completa en yz que se muestra en el recuadro rojo, incluidas 2 secciones ortogonales a lo largo del grosor completo de la muestra indicado por verde (xz) y azul (xy ). Los recuadros discontinuos indican el tumor (identificado por el patólogo). La región del tumor de esta muestra (recuadro rojo discontinuo en a) también se muestra en b como una representación de volumen 3D. Barra de escala: a, 3 mm; b, uno cuadrado de la rejilla roja 1 mm.

Se tomaron cortes gruesos del lóbulo occipital del cerebro humano (Fig. 1) de aprox. 6 mm anterior al polo occipital (tercera sección de 3 mm de espesor en dirección posterior a anterior; ver Fig. 1a y Video complementario 1) y el corte anterior consecutivo (~ 9 mm anterior al polo) del mismo lóbulo occipital (Fig. 1b y Video Suplementario 2). Las decoloraciones oscuras en los cortes sin procesar (paneles más a la izquierda) probablemente se debieron a la acumulación de sangre post-mortem en los vasos en la parte posterior de la cabeza. Los cortes teñidos muestran la franja de Gennari en V1 (Fig. 1, indicada por flechas). La morfología de la muestra aclarada MASH está bien conservada después de la deshidratación, la deslipidación y la coincidencia del índice de refracción (RI), y tanto la materia gris como la blanca se vuelven muy transparentes. La contracción del tejido observada en las muestras aclaradas con MASH es relativamente menor, con una reducción media en el área de superficie medida del 12 % (suplemento Figura 3). Los artefactos negros en la Fig. 1a se derivan de la dispersión de la luz cuando se obtienen imágenes del pegamento caliente utilizado para fijar la muestra en la cámara de imágenes impresa en 3D. Esto ocurre cuando la capa registrada más profunda del volumen de la imagen se extiende sobre el tejido y en el pegamento que se encuentra debajo.

Utilizamos las muestras del lóbulo occipital que se muestran en la Fig. 1 para obtener imágenes multiescala ct-dSPIM. Primero, realizamos un escaneo general del Mosaico 16 de la muestra completa (ver Figs. 1, 2, 4 y el Video Suplementario 3). La figura 1 muestra la reconstrucción 3D de ambos cortes con un volumen de datos Mosaic 16 con una resolución isotrópica de 16,4 µm. La dirección de escaneo se puede reconocer como la dirección de las pilas o franjas de imágenes largas (cada una de 0,74 × 0,74 mm de profundidad y ancho y muchos centímetros de largo), que están dispuestas en mosaico en las dos direcciones restantes para proporcionar una cobertura de muestra 3D completa. Varias capas corticales se pueden distinguir por sus diferencias en la densidad celular (Fig. 1, puntas de flecha blancas) y el borde V1/V2 es visible en esta resolución mesoscópica como un cambio claro en el patrón de capas (Fig. 1, flechas negras).

En la Fig. 2, se muestran representaciones de volumen y Proyecciones de Máxima Intensidad (MIP) ortogonales para visualizar mejor la cobertura de volumen obtenida. Los diferentes ejes (como están etiquetados en el visor de imágenes, consulte la Fig. 4 complementaria) se indican en verde (XZ), rojo (YZ) y azul (XY) respectivamente. La vista XY muestra el mosaico de las pilas de adquisición largas en la dirección Z del volumen (correspondiente al eje X de la etapa durante la adquisición). Las vistas ortogonales también destacan la penetración y la calidad de la etiqueta en toda la muestra de 3 mm de espesor.

Después de adquirir el Mosaico 16 de vista general, se realizó un escaneo del Mosaico 4 con una resolución isotrópica de 4,1 µm de mayor resolución en una región de interés cercana al borde V1/V2 (Figs. 3, 4). Las vistas ortogonales de MIP de 50 µm se indican mediante paneles verde (XY), rojo (XZ) y azul (YZ) respectivamente y muestran diferencias en las capas corticales independientemente de la orientación (Fig. 3, flechas). Las inserciones de mayor aumento (XY: amarillo, XZ: magenta, YZ: cian) son un ROI de la MIP y demuestran cualitativamente una resolución casi isotrópica (muestreada isotrópicamente a 4,1 µm, pero anisotrópica ópticamente debido a una hoja de luz de ~8 µm de espesor) y alta calidad de imagen y etiquetado incluso en lo profundo de la muestra (Fig. 3). Las características corticales mesoarquitectónicas, como las minicolumnas, se vuelven bien visibles a esta resolución (panel magenta de la Fig. 4) y se pueden distinguir capas corticales más delgadas, que no son visibles en los datos del Mosaico 16. La resolución más alta incluso hace posible distinguir algunas de las células individuales más grandes (Figs. 3, 4, paneles ampliados), a pesar de la granularidad de la corteza occipital.

Para demostrar el potencial de las imágenes volumétricas del cerebro para la histología cuantitativa en 3D, realizamos un recuento de células automatizado en un volumen de alta resolución de 0,5 µm (suplementario. Video 4) (Fig. 5; tamaño de vóxel: 0,725 µm × 0,5127 µm × 0,5127 µm). El objetivo era comparar cuantitativamente las densidades celulares en las diferentes capas corticales. Todo el volumen (Fig. 5a) de un conjunto de datos desviados, cosidos y rebanados se segmentó manualmente en las diferentes capas corticales (Fig. 5b). La segmentación de capas no se pudo realizar satisfactoriamente en una región del conjunto de datos, que contenía tejido dañado. Por lo tanto, esta región se excluyó del análisis (partes sin colorear en la Fig. 5b). Posteriormente, los datos se procesaron en una tubería automatizada para filtrar las imágenes sin procesar y segmentar los cuerpos celulares (Fig. 5c, d). El número de todos los segmentos de celdas, mayores de 125 µm3 y completamente contenidos dentro del segmento de capa correspondiente, se utilizó para obtener estimaciones de densidad de celdas para cada capa (Fig. 5e). Los conteos de celdas se combinaron para capas con múltiples segmentos no conectados. Como era de esperar, la capa I muestra la densidad de celdas más baja con poco más de 60 000 objetos segmentados por mm3, aunque la densidad es más alta de lo esperado para esta capa. La capa II, aunque muestra densidades de celdas más altas que la capa I o IIIa (como se esperaba), muestra una densidad más baja de lo esperado a partir de la impresión cualitativa durante la segmentación de la capa. Sorprendentemente, las capas IIIb, V y VI tenían densidades celulares más altas que las capas II o IIIa. La capa IV, que es visiblemente, con mucho, la capa más densa, también exhibió la mayor densidad de celdas en nuestro conjunto de datos, con casi 100 000 objetos segmentados por mm3. Es probable que varias de estas observaciones se expliquen, al menos parcialmente, por efectos de volumen parcial. Para validar los resultados de la segmentación automatizada, realizamos un conteo manual de celdas en el mismo conjunto de datos. El método de segmentación automática de celdas empleado se empleó con un sobreconteo promedio del 36%, en comparación con los conteos manuales (ver la Fig. 5 complementaria). Esto se alivió parcialmente, pero no del todo, por la exclusión de segmentos que se consideraron demasiado pequeños para representar células (<125 µm3). Después de filtrar estas pequeñas estructuras, el segundo resultado automatizado superó en un promedio del 17%. Se observó que las células especialmente grandes en la segmentación automática a menudo se segmentaban en múltiples objetos más pequeños cuando había diferencias de intensidad visibles en el citoplasma o entre el núcleo del citoplasma y el nucléolo.

Desarrollamos FFPE-MASH para secciones de próstata de montaje completo axial humano fijadas con formalina e incluidas en parafina (FFPE). Por primera vez, el protocolo MASH con la etiqueta MASH-NR se aplicó con éxito a muestras grandes de cáncer de próstata de diferentes pacientes (las secciones axiales de montaje completo; Figs. 6, 7; Figs. 1, 2 complementarias; Video complementario 5) . Por lo tanto, demostramos la viabilidad de la aplicación de MASH no solo en tejidos de órganos humanos distintos del cerebro, sino también en material FFPE. Además, pudimos demostrar la viabilidad de imágenes Mosaic 16 ct-dSPIM de alta velocidad (1,7 h/1 cm3) en grandes muestras de cáncer de próstata limpiadas y etiquetadas con MASH-NR. Las amplias vistas mesoscópicas permiten la descripción anatómica de la morfología del tejido prostático y la indicación de posibles regiones neoplásicas (Fig. 6d, h; indicadas con círculos rojos), que se confirmó como adenocarcinoma de próstata por histopatología. La evaluación microscópica de los cortes de hematoxilina-eosina correspondientes mostró que el tumor consiste en glándulas neoplásicas cribiformes y fusionadas, compatible con un adenocarcinoma de próstata de alto grado. Diferentes zonas de capas y compartimentos de la glándula prostática podrían clasificarse en el volumen Mosaic 16 (Fig. 6d, h), a saber, el estroma fibromuscular (AFS), la zona central (CZ), la zona periférica (PZ), la zona de transición (TZ) y la uretra (U). Además, los escaneos Mosaic 4 de mayor resolución permitieron la detección de la morfología del tumor en toda la muestra de tejido y el patólogo sugirió una puntuación de Gleason de 3 y 4 en la sección de montaje completo axial (prostatectomía) (Fig. 2 complementaria).

La visualización en 3D del ct-dSPIM con imágenes de las secciones de próstata de montaje completo axial (Fig. 7; Fig. 2 complementaria) permite la detección del corte transversal de la uretra prostática, que se muestra en las secciones ortogonales en todo el espesor de la muestra. (Fig. 7a, recuadro verde y azul, el inserto discontinuo indica la región del tumor). El volumen 3D que se muestra en la Fig. 7 también muestra la región cancerosa, indicada con la línea discontinua roja en una vista de superficie, según lo confirmado por un patólogo. Las regiones tumorales también se indican en la sección ortogonal en la Fig. 7a en la línea discontinua verde y azul. La figura 7b muestra una mayor ampliación en 3D de la región del tumor que se muestra en el cuadro de línea discontinua roja en a.

Aquí presentamos el novedoso prototipo ct-dSPIM para imágenes de lámina de luz de tejido despejado de muestras de tejido humano a gran escala y nuestra aplicación a secciones de montaje completo axial de próstata y cerebro humano (después de la prostatectomía). Pudimos demostrar la eficiencia y viabilidad de las imágenes ct-dSPIM con lóbulo occipital humano de archivo preparado con MASH19 (Figs. 1–5) y resecciones de próstata (prostatectomía; Figs. 6, 7). El protocolo FFPE-MASH19 con el etiquetado MASH-NR se aplicó con éxito por primera vez a grandes muestras de cáncer de próstata fijadas en formalina e incluidas en parafina (FFPE), como se muestra en las Figs. 6 y 7, así como en las Figs. complementarias. 1 y 2 y la película complementaria 5. Esto no solo muestra la aplicabilidad de MASH a otros tipos de tejidos además del cerebro humano, sino que, de igual importancia, a las muestras FFPE además de las muestras fijadas con formalina. Anteriormente, aplicamos el protocolo MASH a muestras de cerebro humano de archivo fijadas con formalina que se mantuvieron en PFA al 4% hasta su uso. El uso del protocolo MASH en material FFPE podría aumentar su aplicación en otros dominios, ya que el tejido FFPE se ha utilizado comúnmente en investigación y aplicación clínica durante décadas, lo que significa que el efecto potencial en la práctica clínica es considerable. El paso más importante en la modificación de MASH hacia tejido FFPE es la desparafinación inicial en xileno, que debe ser lo suficientemente larga para permitir la disolución completa de la parafina en muestras espesas. Por lo tanto, este paso podría ser omitido mediante la aplicación de esta técnica en muestras frescas, sin fijaciones previas y procesamiento con parafinización, lo que aceleraría considerablemente el tiempo de procesamiento del tejido MASH.

Complementario a la descripción general de las adquisiciones de Mosaic 16 con una resolución isotrópica de 16,4 µm, hemos adquirido escaneos de resoluciones más altas dentro de regiones específicas de interés. Mientras que Mosaic 16 proporciona una descripción general del bloque de tejido completo, Mosaic 4 (resolución isotrópica de 4,1 µm) y Mosaic 0,5 (resolución de casi 1 µm) permiten una evaluación más detallada de partes del mismo tejido. Juntos, este esquema de adquisición de datos multiescala permite la identificación de diferentes características mesoscópicas, como capas, minicolumnas y cuerpos celulares en el cerebro (Fig. 4). Esto permite el análisis completo y detallado de grandes muestras de tejido humano.

El muestreo isotrópico de los conjuntos de datos Mosaic 16 y Mosaic 4 se basa en una relación √2 de la longitud del paso de corte con la resolución del muestreo lateral y está limitada ópticamente por la resolución axial, es decir, por el espesor teórico de la hoja de luz de ~8 µm. La velocidad de adquisición general de los escaneos de Mosaic solo está limitada por la velocidad máxima de escaneo de la platina y actualmente varía de 1,7 h/~1 cm3 para Mosaic 16 a 5 h/~1 cm3 para Mosaic 4 y 15,8 h/~1 cm3 para Mosaic 0,5 . Los escaneos generales de Mosaic 16 permitieron la visualización de gran volumen y alta velocidad de una placa completa de tejido de prostatectomía de 5 mm o una placa completa de tejido de lóbulo occipital humano de 3 mm. Aquí, mostramos escaneos de mosaico de las muestras occipitales con una duración de adquisición entre 2 h 23 min (Mosaic 0.5), 3 h 45 min (Mosaic 4) y hasta 8 h 26 min de toda la muestra occlobe grande de 5 cm3 (Mosaic 16; Figuras 1 a 5). El tiempo para adquirir una exploración Mosaic 16 de la capa superficial de una muestra de próstata, como se muestra en la Fig. 6, fue de 50 min.

En el futuro, el método podría superar los límites actuales de resolución. En teoría, es posible realizar imágenes de ct-dSPIM de vista dual con resolución óptica efectiva de ~ 1 µm, que se ha demostrado principalmente en cultivos celulares. Muy recientemente, surgieron demostraciones en tejido aclarado18,20 aplicando imágenes de doble vista y el subsiguiente procesamiento de deconvolución de doble vista a través de fuertes aceleraciones del procesamiento de deconvolución. Sin embargo, incluso en los desarrollos más recientes20, donde la deconvolución se implementa a través del aprendizaje profundo informado por el proceso de formación de imágenes, los tiempos de procesamiento aún son del orden de unas pocas horas (2 a 3 h) para volúmenes tres órdenes de magnitud más pequeños (1.4 × 2,3 × 0,5 mm3) que las reportadas aquí, lo que implica miles de horas de procesamiento para las muestras muy grandes presentadas aquí, incluso con los métodos actuales más avanzados. Además, las adquisiciones de doble vista duplicarían los tiempos de adquisición actuales, lo que haría que el costo del tiempo total para la mejora de la resolución fuera considerable y poco realista en el contexto relevante de muestras de tejido muy grandes y la futura aplicación clínica en la próstata. Además, para los propósitos de este estudio, con el objetivo de generar imágenes de campo de visión grandes, eficientes y escalables con una resolución suficiente (en lugar de la resolución limitada ópticamente más alta posible), el análisis de costo/beneficio y la factibilidad en términos de tiempo total hace que las imágenes de vista dual actualmente desfavorable. En nuestro estudio actual, hemos incluido datos de imágenes de mosaico ct-dSPIM de un subvolumen de cerebro humano (lóbulo occipital) con una resolución (muestreada) de 0,725 µm × 0,5127 µm × 0,5127 µm. Aunque la resolución óptica real es más baja (del orden de 8,0 µm × 0,8 µm × 0,8 µm con el objetivo 0,4 NA), estos datos de vista única se pueden adquirir a velocidades de datos razonables y son suficientes para los fines previstos, incluida la detección de células individuales, segmentación y recuentos celulares cuantitativos en muestras de cerebro humano. En muestras de cáncer de próstata, una resolución de muestra que oscila entre 16 y 0,5 µm permite obtener imágenes tumorales en 3D eficientes con una calidad de imagen suficiente para la investigación clínica (Figs. 8, 9; Figs. complementarias 4, 5). Para trabajos futuros, vemos oportunidades (p. ej., resolución subcelular para estructuras intracelulares o estructuras axonales o dendríticas de neuronas) y la posibilidad de combinar nuestros esfuerzos actuales con una resolución casi isotrópica más alta. En tales esfuerzos, tanto los enfoques desconvolucionados de doble vista como los enfoques de escaneo axial de vista única merecerán consideración para las imágenes de cerebro y próstata de muestras grandes21,22.

una representación en 3D de la cámara de imágenes más grande que se usa habitualmente en la configuración de ct-dSPIM. Las cámaras tienen un volumen de 0,9 l (20 cm × 15 cm × 3 cm). La cámara se muestra en vista superior (arriba), oblicua (centro) y vista lateral (abajo). b Prototipo de cámara impreso con SLS en PP. c Prototipo de cámara impreso con SLA en Somos®WaterShed XC 11122. Las muestras se montan sobre portaobjetos de vidrio, que se sellan con silicona para evitar que la cámara tenga fugas.

a La luz láser emitida se colima y pasa a través de una lente sintonizable electrónicamente (ETL) (C60-TUNELENS-100, ASI) hacia el "escáner" de hoja de luz (MM-SCAN-1.2, ASI). El ETLf permite controlar electrónicamente la posición axial de la cintura del haz en la muestra. La leyenda continúa en la página siguiente. El escáner contiene un espejo MEMS 2D, que barre el haz gaussiano a través de la muestra una vez por imagen de la cámara para formar una hoja de luz "virtual" o "digital". El otro eje del espejo MEMS se usa para ajustar la hoja de luz coincidente con el plano focal del objetivo de detección. b Las rutas de imagen son las dos posibles rutas de luz (trayectorias A y B). Para cada ruta, el escáner está en un lado y el piezoeléctrico y la cámara de imágenes están en el lado opuesto. La luz viaja a través de los diferentes componentes, como el espejo dicroico y el filtro de emisión, como se muestra (trayectorias de excitación: línea punteada azul; trayectorias de emisión: línea verde continua). La fluorescencia filtrada se enfoca en una cámara sCMOS de 2048 × 2048 píxeles (ORCA-Flash4.0 V3, Hamamatsu) mediante una lente de tubo (C60-TUBE-B, ASI; f = 200 mm).

Uno de los aspectos prometedores de las imágenes volumétricas que se muestran en este artículo es el hecho de que nos permite obtener imágenes de un gran volumen de corteza humana con una alta resolución espacial, lo que a su vez nos permite investigar estructuras celulares en campos de visión extendidos. En el futuro, esto podría en principio permitir cuantificar las densidades de células para diferentes áreas y capas sin sesgo estereológico, ya que los recuentos de células derivados no son extrapolaciones de secciones 2D. Sin embargo, en este punto, las estimaciones derivadas estereológicamente de las densidades celulares aún deben considerarse el estándar de oro, ya que están bien establecidas. Por lo tanto, es interesante cómo nuestros resultados de conteo y segmentación 3D se relacionan con los datos estereológicos en la literatura. Desafortunadamente, las estimaciones de densidad celular en la corteza visual secundaria humana son raras. Las estimaciones que se han calculado con métodos estereológicos, como el fraccionador isotrópico23, generalmente se dan en células por gramo de tejido cerebral y no son fáciles de convertir a nuestras estimaciones de volumen.

Leuba y Garey24 encontraron un número medio de células en el área V2 de 14.7600 bajo un área cortical de 1 mm2, o 63.700 células/mm3. La densidad celular total en nuestro conjunto de datos en todas las capas fue de 81 903 células/mm3. Se considera poco probable que estos recuentos de células más altos en nuestros datos surjan de la contracción del tejido inducida por la eliminación, ya que el cambio observado en el tamaño de nuestras muestras es relativamente menor (ver la Fig. 3 complementaria). Esto es especialmente cierto cuando se compara con otros métodos de limpieza de tejido a base de solventes, que muestran una contracción del tejido mucho mayor, del 30 %14 o incluso del 50 %25. Si tomamos en cuenta el recuento excesivo observado de la segmentación celular automatizada de, en promedio, 17% (Fig. 5 complementaria), nuestros recuentos de células corregidos de 67,980 células/mm3 están relativamente cerca de Leuba y Garey. Cuando nos enfocamos en las capas individuales, nuestra densidad celular en la capa IV está generalmente en buen acuerdo con Leuba y Garey con 97 529 células/mm3 (nuestros datos) frente a 10 7316 células/mm3 24 Para derivar las densidades de todas las células, multiplicamos sus informes números de neuronas con su relación de neurona/glía informada y agregó estas dos poblaciones, ya que solo proporcionan densidades de población de células completas para toda el área, pero no en su tabla específica de capa. Desafortunadamente, Leuba y Garey no enumeran las densidades de todas las capas, pero informan las capas supragranulares II y III, así como las capas infragranulares V y VI juntas. Informan una densidad de células supragranulares de 63.558 células/mm3, que es similar al número de células que encontramos en la capa IIIa (66.884 células/mm3). Sin embargo, tanto la capa II (71.599 células/mm3) como la IIIb (82.712 células/mm3) muestran un mayor número de células y, por tanto, la densidad celular supragranular combinada también es mayor, con 77.807 células/mm3. Como se mencionó anteriormente, la densidad celular muy alta observada en la capa IIIb fue sorprendente, dada la apariencia visual de esa capa como menos densa con neuronas piramidales más grandes y dispersas. Una posible explicación para esta discrepancia podría ser un efecto de volumen parcial de la muy densa capa adyacente IV, que surge de una segmentación manual imperfecta de la capa. Otro posible factor contribuyente podría ser una tendencia observada de la segmentación celular automatizada a dividir las neuronas más grandes en múltiples segmentos cuando muestran diferencias de intensidad sobre su volumen citoplasmático (ver la Fig. 5 complementaria). Esta tendencia a segmentar las células más grandes en múltiples segmentos condujo a un conteo promedio excesivo de la segmentación celular automatizada de alrededor del 17 %, después de que se filtraron los segmentos de menos de 125 µm3. Si tenemos en cuenta este recuento excesivo, el recuento de células supragranulares combinado de 64.580 células/mm3 está considerablemente más cerca de Leuba y Garey. Ambos factores también podrían explicar las mayores densidades de células observadas en nuestros datos para las capas V, ya que la alta densidad de la capa V (88 781 células/mm3) fue igualmente inesperada. Los efectos de volumen parcial no pudieron explicar la densidad similarmente alta de la capa VI (81 904 células/mm3), aunque es probable que la división de los cuerpos celulares grandes provoque un recuento excesivo. Por lo tanto, nuestra densidad celular infragranular combinada es sustancialmente mayor que la informada por Leuba y Garey (86 579 células/mm3 frente a 53 658 células/mm3). Incluso si tomamos en cuenta el conteo excesivo de la segmentación automatizada, nuestras densidades de células infragranulares observadas serían más altas que las de Leuba y Garey (71,861 células/mm3). Las mejoras en la calidad de la segmentación podrían aliviar al menos algunas de estas discrepancias y acercar las estimaciones de celdas en esta área a las estimaciones estereológicas. Zhao et al. use una segmentación basada en aprendizaje profundo en datos volumétricos del cerebro humano despejado14. Cabe señalar que los autores de este artículo informan densidades mucho más altas (16,2000–21,6000 células/mm3) que Leuba y Garey o el trabajo informado aquí, aunque no investigaron diferentes áreas.

Un posible aspecto que podría explicar la variación del número de células en estos enfoques es también la cantidad de contracción introducida durante el procesamiento histológico. Dado que el enfoque de limpieza del tejido utilizado en este estudio es diferente al de Zhao et al. 26, y se sabe que produce una contracción relativamente menor (12 % en comparación con el 30 % informado en Zhao et al.; consulte la Fig. 3 complementaria), esto podría explicar, al menos en parte, esta discrepancia. Otro estudio publicado recientemente que aplicó una canalización de segmentación celular muy sofisticada27 volvió a arrojar resultados muy diferentes con densidades de neuronas de 14 000 a 24 000 neuronas/mm3 (lo que significa alrededor de 28 000 a 47 500 células/mm3 cuando se aplica la proporción de neuronas/glía de Leuba y Garey). El enfoque de limpieza utilizado en este estudio es un protocolo de limpieza de tejido acuoso, que expande el tejido. Esto, a su vez, podría explicar las estimaciones más bajas. Además, se basan en el etiquetado de anticuerpos para identificar las poblaciones de células neuronales, en lugar de un tinte orgánico más general con un peso molecular más pequeño, que también podría explicar algunas de las diferencias observadas. Por último, también es posible que el método 2D estereológico implementado por Leuba y Garey conduzca a un recuento insuficiente sistemático, al extrapolar los recuentos de células 2D en secciones a un gran volumen de tejido.

El diagnóstico histopatológico clásico del cáncer de próstata, en particular de los tumores multifocales, es un desafío3. Además, la evaluación de toda la biopsia central, o la resección de toda la muestra, demoraría hasta 10 días, lo cual es ineficiente y muy costoso, y casi nunca se realiza en la práctica clínica estándar. Por lo tanto, las posibles imágenes de mosaico ct-dSPIM de la próstata, en colaboración con oncólogos y patólogos en el hospital local, abren nuevas vías para futuros diagnósticos de cáncer.

Un trabajo reciente ha demostrado la utilidad de LSFM para examinar biopsias con aguja gruesa de próstata humana de 1 a 2,5 mm de espesor por medio de un sistema LSFM abierto construido en casa. En cambio, aquí se examinaron secciones completas de próstata de montaje completo axial de 5 mm de espesor con escaneos Mosaic 16 y 4 ct-dSPIM en aprox. 1 a 5 h, lo que ahorra tiempo y permite una evaluación general relativamente rápida de toda la biopsia (Figs. 6, 7; Figs. 1, 2 complementarias; Video complementario 5). Además, esto permite un examen retrospectivo de una gran cantidad de muestras de cáncer de próstata de archivo (hasta 8 muestras por día). Las imágenes en 3D de gran volumen pueden permitir la visualización de tumores en capas o regiones más profundas y en toda la muestra de resección de próstata gruesa. Esto tiene el potencial de proporcionar nuevos conocimientos sobre la estructura del tejido prostático tanto canceroso como benigno. Hasta la fecha, la información actual sobre la arquitectura de la próstata en 3D es limitada, ya que se basa en el examen de resonancia magnética, que no permite un análisis detallado y de alta resolución del órgano completo, incluida la formación de glándulas, el lumen y la capa epitelial. Sin embargo, en la práctica histopatológica actual, la técnica utilizada con más frecuencia es una combinación de microscopía de campo brillante clásica y tres o cuatro niveles de secciones de tejido de 5 µm de espesor, lo que da como resultado información de tejido 2D. Esto puede dar lugar a una subclasificación del tumor o a un diagnóstico falso negativo en el caso del carcinoma multifocal, ya que estos se encuentran principalmente en los niveles profundos de los bloques de tejido. Por lo tanto, es de gran valor para el patólogo y el oncólogo obtener información novedosa de gran volumen y alta resolución en 2D y 3D sobre la arquitectura detallada del tumor de próstata utilizando muestras de próstata de pacientes de 5 mm de espesor (Figs. 6, 7; Figs. complementarias 1, 2 ; Vídeo complementario 5). Las imágenes cuantitativas de láminas de luz de esas muestras de cáncer de próstata más gruesas (prostatectomía) pueden mejorar la precisión del diagnóstico. Los resultados de este estudio muestran que es posible detectar tumores con nuestro método de obtención de imágenes ct-dSPIM de tejido aclarado e incluso permitir la calificación de la puntuación de Gleason (Fig. 2 complementaria), incluida la detección del proceso neoplásico y distinguir el tejido prostático benigno normal del adenocarcinoma. Tanto las exploraciones Mosaic 16 (Figs. 6, 7) como Mosaic 4 (Figs. 1, 2 complementarias; Video complementario 5) permitieron la detección de tumores en la sección axial de próstata de montaje completo de diferentes pacientes.

Además, dado que las adquisiciones de Mosaic en ct-dSPIM permiten el examen 3D de alta velocidad de muestras de próstata a gran escala, es factible desarrollar canalizaciones de imágenes de alto rendimiento, durante aprox. 20 muestras en 10 días, si solo se captura una muestra a la vez. El procesamiento estándar de la próstata incluye al menos 24 h de fijación, seguido de macroscopia y procesamiento en un procesador de tejido de infiltración al vacío (al menos 24 h). Por lo tanto, este paso podría omitirse mediante la aplicación del enfoque MASH y ct-dSPIM propuesto en una muestra de resección fresca. Esto podría tener un efecto considerable en la práctica clínica y acelerar el flujo de trabajo de diagnóstico. Dado el tamaño del contenedor de imágenes (consulte la Fig. 8), se podrían acomodar múltiples muestras en paralelo en el ct-dSPIM, lo que podría hacer que las imágenes sean aún más eficientes. Esto puede resultar en una recopilación rápida de conocimientos y es factible para varias muestras de pacientes en diferentes etapas de la enfermedad al tiempo que proporciona datos suficientes para las estadísticas y la cuantificación de la variación y localización del tumor.

En resumen, nuestro método tiene el potencial de mejorar la obtención de imágenes de muestras de resecciones de cáncer de próstata humano. Proporciona una visualización 3D novedosa de toda la muestra en detalle, lo cual es inviable en tiempo y recursos con los métodos tradicionales. También podría conducir a imágenes de próstata más rápidas, lo que tiene beneficios para la eficiencia de la práctica clínica, así como generar nuevas oportunidades para la investigación (tejido de archivo). Además, podría proporcionar diagnósticos más precisos, especialmente en carcinomas multifocales.

Demostramos imágenes de mosaico a gran escala en el sistema ct-dSPIM y demostramos que pudimos superar las limitaciones de otros microscopios de hoja de luz existentes para una cobertura de muestra humana muy grande16,28. El ct-dSPIM utiliza una geometría oblicua con los objetivos sumergidos directamente en el líquido de imágenes desde arriba, a diferencia de otras configuraciones publicadas recientemente17,28. En sistemas anteriores, los objetivos están ubicados debajo de la muestra, lo que requiere imágenes a través del fondo de vidrio de la cámara. El tamaño de la muestra está potencialmente limitado aún más por esta geometría, ya que la distancia de trabajo (WD) se pierde efectivamente al obtener imágenes a través del vidrio y una lente adicional. Otros sistemas usan una geometría de hoja de luz más estándar (es decir, vertical, no oblicua) y usan una forma novedosa de generar la hoja de luz para obtener imágenes de muestras muy grandes11. En estos sistemas, la extensión lateral será finalmente limitada, ya que incluso en las muestras más transparentes, se producirá cierto grado de dispersión de la luz y se deteriorará la calidad de la imagen más profundamente en el tejido. Esto se puede evitar con una configuración oblicua como la ct-dSPIM, dejando el tamaño lateral de la muestra limitado únicamente por el rango de desplazamiento de la platina del microscopio.

Otros cambios de hardware, como un escáner de lente cilíndrica (en lugar de una hoja de luz láser escaneada digitalmente) y los ajustes de la trayectoria de mosaico del escenario, como una trayectoria serpenteante, podrían aumentar aún más la velocidad de la imagen de 2 a 4 veces. Esto abriría una escala completamente nueva en la investigación del tejido cerebral sano y enfermo post-mortem. Otras modificaciones de hardware de la configuración de ct-dSPIM, como NA más alta y objetivos de aumento, así como un enfoque de hoja de luz escaneada axialmente, podrían permitir un aumento en la resolución de imágenes a costa del campo de visión o tiempo para imagen del mismo tamaño de muestra. Estos desarrollos futuros podrían permitir obtener imágenes de diferentes estructuras y marcadores en partes más grandes del cerebro, con el potencial de proporcionar nuevos conocimientos sobre la neuroanatomía humana sana y patológica.

Además, establecer más opciones de etiquetado, como el etiquetado de moléculas pequeñas de la angioarquitectura cerebral, así como estrategias de etiquetado de anticuerpos que también son adecuadas para la obtención de imágenes de muestras grandes con ct-dSPIM, podría ampliar aún más las posibilidades. En el futuro, todo el proceso desde el procesamiento de tejidos (con limpieza y etiquetado MASH) hasta el análisis de datos e imágenes de mosaico ct-dSPIM podría extenderse a partes más grandes del cerebro y regiones del cerebro, como todo el lóbulo temporal u occipital en 3– Losas de 5 mm de espesor. Dado que el tamaño de la muestra lateral puede ser potencialmente mucho mayor en la configuración actual, incluso sería posible obtener imágenes de cortes de cerebro completos, siempre que se establezca una tubería de procesamiento de tejidos para muestras de este tamaño.

Aunque demostramos el uso de MASH humano y próstata preparados como casos de aplicación para adquisiciones a gran escala en el ct-dSPIM, esta técnica podría extenderse potencialmente a una variedad de otros tejidos de mamíferos humanos y no humanos también. Esto podría hacer que la combinación de MASH con imágenes ct-dSPIM sea una herramienta poderosa para estudios anatómicos y patológicos en general.

En conclusión, pudimos demostrar que el ct-dSPIM es una herramienta excelente para obtener imágenes de láminas de luz 3D cuantitativas eficientes de muestras de tejido humano muy grandes. Pudimos mostrar la aplicación de imágenes ct-dSPIM a muestras de cáncer de próstata (lóbulo occipital) y cerebro humano post mortem aclaradas ópticamente a escala cm3 (secciones de próstata de montaje completo axial). Por medio de una visión general rápida y seguida de escaneos Mosaic de alta resolución de ROI identificados, pudimos realizar el conteo de células cerebrales humanas en las muestras del lóbulo occipital y la calificación de puntuación de Gleason en las secciones axiales de próstata de montaje completo. En el futuro, las imágenes de ct-dSPIM tienen el potencial de aplicarse en investigaciones clínicas y fundamentales más amplias de muestras de tejido grandes.

Se tomaron muestras de lóbulo occipital humano de 3 donantes de cuerpos humanos (donante 1: hombre, 98 años; donante 2: mujer, 101 años; donante 3: mujer 90 años; sin enfermedades neuropatológicas conocidas, respectivamente) del programa de donación de cuerpos del Departamento de Anatomía y Embriología, Universidad de Maastricht (UM). Se utilizó tejido de los donantes 2 y 3 para la evaluación de la contracción (Fig. 3 complementaria). Los donantes de tejidos habían dado su consentimiento informado y por escrito para la donación de su cuerpo con fines de enseñanza e investigación, tal como lo regula la ley holandesa para el uso de restos humanos para la investigación científica y la educación ("Wet op de Lijkbezorgiing"). En consecuencia, en el Departamento de Anatomía y Embriología de la UM, Maastricht, Países Bajos, se conserva un codicilo escrito a mano y firmado por el donante que posó cuando aún estaba vivo y coleando. Los cerebros humanos se fijaron primero in situ mediante perfusión de todo el cuerpo a través de la arteria femoral. Bajo una presión de 0,2 bar, el cuerpo se perfundió con 10 l de líquido de fijación (1,8 % en volumen de formaldehído, 20 % de etanol, 8,4 % de glicerina en agua) en 1,5 a 2 h. A partir de entonces, el cuerpo se conservó al menos 4 semanas para la postfijación, sumergido en el mismo líquido. Posteriormente, las muestras de cerebro se recuperaron mediante disección calvariana y se almacenaron en paraformaldehído al 4 % en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 0,1 M durante 14 a 30 meses.

Todas las muestras de resección de próstata se recuperaron del archivo del Departamento de Patología del Centro Médico de la Universidad de Maastricht (MUMC+) en el período comprendido entre 2007 y 2015. Para esta publicación, se utilizaron tres muestras. Este estudio fue aprobado por el Comité de Revisión de Ética Médica del Centro Médico de la Universidad de Maastricht en los Países Bajos (2020-1537). Todos los especímenes se recolectaron y estudiaron de acuerdo con el protocolo del Código holandés de conducta para la investigación observacional con datos personales y tejidos (2004)29. Los especímenes fueron recibidos con fines diagnósticos y procesados ​​de acuerdo con los procedimientos operativos estándar internos de acuerdo con las recomendaciones nacionales e internacionales. El grosor de la sección axial de montaje completo de la muestra de próstata oscila entre 3 y 5 mm. En resumen, las muestras se fijaron inicialmente con formalina tamponada al 4 % durante 24 h y luego se procesaron en el procesador de infiltración al vacío Tissue Tek VIP6 (Sakura Finetek USA, Inc, Torrance, CA, EE. UU.), donde las muestras se deshidrataron sumergiéndolas en una serie de soluciones de etanol de concentración creciente hasta alcanzar un alcohol puro y sin agua. Este paso fue seguido por una limpieza del tejido en una solución de xileno, con la consecuente infiltración de la muestra en parafina. Finalmente, las muestras se incluyeron en parafina de acuerdo con los procedimientos de diagnóstico patológico de rutina en el HistoCore Arcadia Embedding Center (Leica Microsystems BV, Ámsterdam, Países Bajos).

Todas las muestras se aclararon y etiquetaron con rojo neutro usando el protocolo MASH-NR como se describe en nuestra publicación anterior19. Dado que el protocolo clínico de próstata estándar producía muestras incluidas en parafina fijadas con formalina (FFPE), se utilizó un protocolo MASH modificado (FFPE-MASH-NR) para procesar muestras de próstata FFPE. En el protocolo FFPE-MASH-NR, las muestras de próstata tenían que desparafinarse antes del aclaramiento MASH estándar. Para este propósito, las muestras se incubaron durante 3 a 7 días en xileno dependiendo del tamaño de la muestra (para cada muestra se utilizó un volumen de xileno de aproximadamente 200 ml). Los bloques de parafina se recortaron manualmente tanto como fue posible antes de la incubación. Después de eso, las muestras se rehidrataron 1 h cada una en 100 ml de xileno, 2 × 100 %, 70 %, 50 % de etanol (EtOH) y finalmente PBS. Las muestras rehidratadas se mantuvieron en una solución de PFA tamponada al 4% hasta su uso. La limpieza y el etiquetado de las muestras con FFPE-MASH siguieron los mismos pasos que se describen a continuación para las muestras de cerebro. Durante todos estos pasos, las muestras de próstata se mantuvieron en recipientes de vidrio individuales y se incubaron en al menos 50 ml de la solución respectiva. Los recipientes se mantuvieron en un agitador en todo momento.

Todas las muestras se aclararon y etiquetaron con rojo neutro usando el protocolo MASH-NR como se describe en nuestra publicación anterior19. En resumen, las muestras se deshidrataron durante 1 h cada una en una mezcla acuosa (v/v) de 20, 40, 60, 80 y 100 % de metanol (MeOH) a temperatura ambiente (RT) y 1 h en 100 % MeOH a 4 ºC Después de eso, las muestras se blanquearon durante la noche en una solución enfriada recién preparada de H2O2 al 5 % en MeOH a 4 °C. A continuación, las muestras se rehidrataron durante 1 h cada una en MeOH al 80 %, 60 %, 40 % y 20 % y se permeabilizaron en solución salina tamponada con fosfato + Triton X-100 al 0,2 % (v/v) pH 7,4. A esto le siguió una incubación de 1 h en una solución acuosa recién filtrada de disulfito de potasio al 50 % (p/v) y 5 enjuagues rápidos seguidos de un lavado de 1 h en agua destilada. El marcaje para la citoarquitectura se realizó durante 5 días en una solución de rojo neutro al 0,001 % en tampón fosfato-citrato (también conocido como tampón McIlvain)30 a pH 4. Las muestras se voltearon después de la mitad del tiempo de incubación. Después del etiquetado, las muestras se lavaron 2 x 1 h en tampón McIlvain pH 4 y se deshidrataron durante 1 h cada una en MeOH al 20 %, 40 %, 60 %, 80 %, 2 x 100 %. La eliminación de lípidos se realizó durante la noche en diclorometano (DCM) al 66 %/MeOH al 33 %, seguido de 2 x 1 hora en DCM al 100 %. Finalmente, las muestras se incubaron con cinamato de etilo (ECi) como solución de ajuste del índice de refracción (RIMS). Todos los pasos se llevaron a cabo a temperatura ambiente.

Para la incubación de múltiples cortes coronales de lóbulos occipitales completos, se utilizó un frasco de vidrio de 8 cm de diámetro, con espaciadores de polietileno o politetrafluoretileno, para brindar compatibilidad con los solventes orgánicos utilizados durante la delipidación. Para evitar que los espaciadores de plástico dejaran huellas en el tejido, se colocaron trozos de papel de filtro por encima y por debajo del tejido. El frasco de vidrio se llenó por completo para cada paso descrito anteriormente (un volumen de aproximadamente 200 ml) y las soluciones se agitaron constantemente con un agitador magnético durante todo el procesamiento.

Para evaluar la contracción del tejido inducida por MASH, medimos el área de superficie de un total de 13 cortes de cerebro de tres donantes diferentes (muestra "Occlobe16" n = 4, tejido del mismo donante como se muestra en las Figs. 3–7; muestra "Occlob10" n = 6; muestra "Hemi6" n = 3, cortes coronales anteriores al lóbulo occipital). Los cortes "Occlobe10" (n = 6) se tomaron de otro lóbulo del que se tomaron imágenes para un proyecto independiente. Se tomaron cortes "Hemi6" (n = 3) de material preseccionado proporcionado por el Departamento de Anatomía y Embriología de la Universidad de Maastricht. Estos cortan manualmente secciones coronales del cerebro de aprox. Se cortaron más muestras de 1 cm de espesor en muestras de 5 mm de espesor, antes del procesamiento MASH. Se tomaron imágenes digitales escaladas antes de la limpieza y al final del procedimiento de limpieza, después del emparejamiento de RI. La circunferencia de las rebanadas de tejido se segmentó manualmente en FIJI y se midió el área antes y después de la limpieza (Figura complementaria 3).

Para las imágenes ct-dSPIM, se imprimieron en 3D cámaras de imágenes grandes personalizadas (20 × 15 × 3 cm, volumen de aprox. 900 ml) (Fig. 8) en material resistente a ECi (Somos®WaterShed XC 11122) o polipropileno (PP ). La impresión fue realizada por SKM Rapid Modeling bv (Helmond, Países Bajos) a través de estereolitografía (SLA) para las impresiones de cuencas hidrográficas o producida a través de sinterización selectiva por láser (SLS) por Materialise NV (Lovaina, Bélgica) para las cámaras de PP. El área de imágenes de las cámaras se equipó con un portaobjetos de vidrio de 178 × 127 × 1,2 mm (Ted Pella Inc., Redding, EE. UU.) como fondo para disminuir los reflejos de luz y se pegó con sellador de silicona pura. Todas las muestras se pegaron al portaobjetos de vidrio en la cámara de imágenes impresas en 3D con pegamento caliente (Rapid AB, Hestra, Suecia). Luego, la cámara de imágenes se llenó con al menos 500 ml de solución ECi (RI 1.56) con cantidades más grandes según el tamaño de la muestra.

El microscopio ct-dSPIM está destinado a la obtención de imágenes en 3D de muestras de tejido limpias muy grandes con un grosor de hasta 5 mm y un tamaño lateral limitado solo por el recorrido de la platina XY y los límites de tiempo de obtención de imágenes. Se derivó del sistema diSPIM (microscopía de iluminación de plano selectivo invertida de doble vista)31 y se desarrolló conjuntamente con Applied Scientific Instrumentation Inc. (ASI, Eugene, EE. UU.). En la Fig. 9 se muestra un esquema óptico del sistema ct-dSPIM. La fuente de luz láser (Coherent obis, línea láser 552 nm LS 40 mW LASER SYSTEM: FIBER PIGTAIL: FC) tiene una salida de fibra monomodo con un apertura (NA) de 0,12. La luz láser emitida se colima y pasa a través de una lente sintonizable electrónicamente (ETL) (C 60-TUNELENS-100, ASI) hacia el "escáner" de hoja de luz (MM-SCAN-1.2, ASI). La lente sintonizable permite controlar electrónicamente la posición axial de la cintura del haz en la muestra. El escáner contiene un espejo microelectromecánico (MEMS) 2D que barre el haz gaussiano a través de la muestra una vez por imagen de la cámara para formar una hoja de luz "virtual" o "digital". El otro eje del espejo MEMS se usa para ajustar la l coincidente con el plano focal del objetivo de detección. El haz de exploración se transmite al plano focal posterior del objetivo de iluminación de inmersión múltiple (#54-10-12, Óptica especial/Instrumentación científica aplicada (ASI).

La fluorescencia se recoge mediante un objetivo de detección de inmersión múltiple idéntico (n.º 54-10-12, Óptica especial/ASI) y da como resultado una resolución de ~1 μm lateralmente (dependiendo del RI de la solución de imagen). Los objetivos son compatibles con un rango de índice de refracción (RI) de 1,33 a 1,56 y una distancia de trabajo (WD) de 12 mm. Tanto la apertura numérica (NA) como la distancia focal efectiva (EFL) varían con el índice de refracción, pero para ECi, la NA es de ~0,43, la EFL es de 11,2 mm y el aumento es de 17,9×. La profundidad máxima de imagen es de 5 mm y está limitada por el espacio libre físico de los dos objetivos. Los objetivos están sostenidos por mecánicas que incluyen ajustes finos manuales para co-alinear los dos objetivos (SPIM-DUAL-K2, ASI).

Los caminos de excitación y detección se combinan en un espejo policroico (ZT488/543/635rpc-UF2, Chroma) y una rueda de filtros motorizada (FW) (FW-1000-8, ASI) con tres filtros de emisión (ET519/26 m; ET576 /31 m; ET655lp, Chroma), que permite obtener imágenes en tres colores. En este trabajo, el objetivo era obtener imágenes eficientes de un solo color en volúmenes muy grandes y solo se utilizó la banda de color media con el filtro de emisión ET576/31 m. La fluorescencia filtrada se enfoca en una cámara científica de semiconductores de óxido de metal complementario (sCMOS) de 2048 × 2048 píxeles (ORCA-Flash4.0 V3, Hamamatsu) mediante una lente de tubo (C60-TUBE-B, ASI; f = 200 mm) . La lente del tubo proporciona un muestreo de Nyquist de 0,3625 μm/píxel con un RI de 1,56, con un campo de visión horizontal de 0,74 mm sobre los 2048 píxeles de la cámara.

Las tiras de imágenes se recopilan con una combinación de escaneo de platina (es decir, la muestra se mueve a través de una hoja de luz estacionaria usando la platina XY, Fig. 4 complementaria), mosaico lateral/vertical usando una platina XY motorizada (MS-8000, escaneado optimizado). ) y actuadores Z motorizados (Focusing Translation Platform (FTP-2050), ASI). La velocidad de adquisición es >108 voxels/seg con un tiempo de exposición de 10 ms. El firmware de escaneo de escenario emite un disparador TTL interno (tiempo de vida) que garantiza el posicionamiento de inicio reproducible (<1 μm) de cada tira de imagen. Un controlador de tigre ASI (TG-1000) contiene componentes electrónicos de control para las etapas motorizadas, el espejo MEMS, la lente sintonizable y los activadores de cámara y láser. Sincroniza todos estos elementos con una precisión de subms durante cada tira de imagen en función del disparador de escaneo de etapa inicial.

El microscopio está controlado por µManager 1.4.22, un software gratuito de control de microscopios de código abierto32. El complemento ASI diSPIM en µManager se utiliza tanto para alinear el microscopio como para configurar y realizar adquisiciones. El complemento de control de escenario se utiliza para realizar ajustes de ETL estáticos en ambos ETL (V, izquierda; W, derecha).

Para algunas aplicaciones, la información 3D de una sola vista o pila es suficiente. Sin embargo, para las imágenes de muestras grandes que se abordan aquí, se utilizan mosaicos extensos a lo largo de las adquisiciones de mosaicos yz, generalmente en combinación con etapas de pilas de imágenes largas escaneadas en la dirección x (Fig. 4 complementaria). Como sistema de vista dual, el ct-dSPIM tiene la ventaja adicional de que el papel de los dos objetivos se puede invertir para recolectar otra pila desde una dirección perpendicular a expensas del doble del tiempo de imagen. Sin embargo, dado que el énfasis aquí está en imágenes de gran volumen rápido de resolución> 1 μm, el modo de imágenes de vista dual no se emplea en este trabajo.

Se tomaron imágenes de la muestra de tejido de próstata y cerebro humano marcada con MASH-NR con la línea láser de 552 nm a 1 mW (OBIS) y con un tiempo de exposición de 10 ms en todo momento. Para ambas muestras, se realizó una exploración general de los cortes de tejido completos a escala de centímetros cúbicos con una resolución de muestra isotrópica de 16,4 µm (que denominamos adquisición Mosaic 16). Además, para la muestra de cerebro humano, hemos realizado un escaneo multiescala que consta de: (a) un escaneo general Mosaic 16 de todo el corte de tejido, (b) una adquisición para un FoV grande seleccionado (~15 × 17 × 3 mm) con resolución muestreada isotrópica de 4,1 µm (denominada Mosaic 4) y (c) una adquisición para un FoV más pequeño (~5 × 10 × 3 mm) con alta resolución (0,725 µm × 0,5127 µm × 0,5127 µm) para una región de interés específica ( denominado Mosaico 0.5). La velocidad de creación de imágenes es diferente según el mosaico de imágenes que se implemente. Para exploraciones rápidas de descripción general de Mosaic 16, la velocidad de generación de imágenes es de 1,7 h/1 cm3 y para exploraciones con ROI Mosaic 4 y Mosaic 0,5 de mayor resolución, la velocidad de generación de imágenes es de 5 h/1 cm3 y 15,8 h/1 cm3, respectivamente (Tabla 2).

Mientras que los escaneos Mosaic 16 proporcionan conjuntos de datos 3D de un bloque de tejido completo con una resolución de muestra mesoscópica isotrópica de 16,4 µm, Mosaic 4 y Mosaic 0.5 muestran regiones de interés con una resolución de muestra isotrópica de 4,1 µm y casi 1 µm, respectivamente. Los pasos de corte en la adquisición son 11,60 µm para Mosaic 16, 2,90 µm para Mosaic 4, lo que conduce a resoluciones muestreadas isotrópicas después del desvío debido a la escala √2 (Fig. 4 complementaria). Los conjuntos de datos sin procesar se muestrearon aún más de la siguiente manera: para Mosaic 16, 16 × en el plano (32 × 45 píxeles) y para Mosaic 4, 4 × (128 × 186 píxeles), para igualar el tamaño de paso del microscopio y producir un isotrópico. conjunto de datos de 16,4 µm (Mosaic 16) o 4,1 µm (Mosaic 4) isotrópico después de desviar. Para el Mosaic 0.5, el paso de corte fue de 0.363 µm y se realizó una reducción de muestreo en el plano de 2 × 2. Con estos parámetros, los escaneos de Mosaic 16 se adquieren a la velocidad más alta posible, limitada solo por la velocidad máxima de escaneo de la etapa. Los escaneos de Mosaic 4 se adquieren cerca de una muestra de Nyquist de la resolución óptica axial de ~8 µm (es decir, espesor teórico de la hoja de luz), y los escaneos de Mosiac 0.5 se adquieren cerca de una muestra de Nyquist de la resolución óptica lateral en el plano de ~1 µm. resolución. Al adquirir volúmenes de imágenes con el ct-dSPIM, que utiliza el escaneo de platina para mover la muestra a través del plano de imágenes (es decir, la hoja de luz), los ejes no corresponden a las coordenadas XYZ ortogonales. En cambio, el eje Z de la cámara está en un ángulo de 45° hacia la dirección de exploración del escenario (Fig. 4 complementaria). Por lo tanto, la adquisición de imágenes escaneadas por etapas conduce a una forma de pila paralelepipédica sesgada con ejes no ortogonales, que se deformará cuando se vea en el sistema de ejes ortogonales. Una operación de enderezamiento transforma la pila paralelepípeda sesgada en una pila rectangular con los ejes ortogonales tradicionales (Fig. 1b complementaria). El etiquetado del eje utilizado en las figuras de este trabajo es el etiquetado del eje del visor de imágenes con el eje x a lo largo del grosor del tejido de 3 a 5 mm y el eje z a lo largo de la dirección de escaneo de las pilas de imágenes (Fig. 4c complementaria).

El muestreo descendente se realiza escalando las imágenes al tamaño de píxel final con la función de escalado en Fiji33. La reducción de muestreo redujo el tamaño del conjunto de datos a ~3–4 GB para un escaneo Mosaic 16 de un corte completo del lóbulo occipital. Estos datos de muestreo reducido se procesaron posteriormente con FIJI PlugIn BigSticher34. Primero, los datos se desviaron con la opción "(des)sesgo" y luego se unieron a través de la opción Correlación de fase, sin más reducción de muestreo. Luego, los datos unidos se volvieron a guardar como un archivo tif de 16 bits. En algunos casos, para la visualización, el conjunto de datos fusionados isotrópicos finales se volvió a cortar en FIJI a lo largo de la dirección YZ para proporcionar una vista coronal de las muestras. El tiempo total de reducción de muestreo para un escaneo de Mosaic 16 y Mosaic 4 toma 12 h en una estación de trabajo de PC con 32 RAM, Intel(R) Xeon(R) CPU E5-1650 v3 @ 3.50 GHz y 10 HDD de almacenamiento. Además, para un Mosaic 0.5 no se necesita reducción de muestreo. El tiempo total de unión con BigSitcher PlugIn es de aproximadamente 1 h para Mosaic 16 y 2 h para Mosaic 4, respectivamente. Para Mosaic 0.5 se necesitan aproximadamente 3 días de tiempo de costura en BigStitcher.

La visualización 3D y el recuento de células de las pilas de volumen se realizaron con el software arivis Vision4D (versión 3.4.0). Para este propósito, se utilizó una sola pila de una adquisición de Mosaic 0.5 en el área V2 del cerebro humano y que cubría todas las capas corticales. La pila enderezada, cosida y recortada se procesó con una canalización automatizada en Vision4D. Los datos sin procesar primero se filtraron con la opción de filtro de morfología y las celdas se segmentaron con el método de segmentación "buscador de manchas". Para derivar el número de células por capa, las capas corticales y la sustancia blanca se segmentaron manualmente con la herramienta de selección de polígonos en todo el volumen. La capa III se dividió en dos subcapas IIIa y IIIb basándose en diferencias notables de densidad y tamaño celular (p. ej., neuronas piramidales grandes que aparecen en la capa IIIb). Luego se aplicó una segunda canalización para crear compartimentos basados ​​en las capas segmentadas manualmente, que incluían solo los objetos segmentados de la canalización de segmentación celular que estaban completamente contenidos dentro de los bordes del segmento de capa y tenían un tamaño superior a 125 µm3. Las características derivadas de estos segmentos compartimentados se extrajeron luego en tablas itemised.csv.

Para visualizar la resolución isotrópica de los conjuntos de datos Mosaic 16 y Mosaic 4 de menor resolución, se crearon vistas ortogonales en FIJI33 recortando los datos y creando MIP para cada eje. Los videos fueron creados tanto con FIJI como con Vision4D. Las figuras fueron creadas con biorender (https://www.biorender.com).

Para validar la tubería de segmentación de células automatizada, se realizó un recuento de células manual en el mismo conjunto de datos. El volumen de datos se dividió en una cuadrícula de 100 × 100 µm, que se extendía por toda la profundidad de la pila, en el entorno Vision4D con un script de Python personalizado. Posteriormente, se seleccionaron pseudoaleatoriamente 10 planos y 5 ROI diferentes por plano utilizando la función "randi" en MATLAB (R2015b, MathWorks Inc.) como generador de números aleatorios. Las células se contaron manualmente dentro de cada ROI, considerando solo las células que estaban completamente contenidas dentro de los límites de la ROI o que se cruzaban con el borde izquierdo y/o inferior del cuadro de 100 × 100 µm (Fig. 3A complementaria). Se crearon gráficos de violín de la distribución de datos en MATLAB utilizando el script de Bechtold (2016; https://doi.org/10.5281/zenodo.4559847) para las celdas contadas manualmente, los resultados de segmentación del "buscador de blob" sin filtrar, así como los resultados filtrados contienen solo segmentos de más de 125 µm3 ("cuerpos celulares filtrados"; figura complementaria 5b).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de microscopía sin procesar se almacenan en un servidor de facultad local. Los datos de origen numéricos para la validación del cerebro humano y las mediciones de contracción se muestran en los Datos complementarios 1 y 2. Todos los demás datos están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Descargar referencias

Agradecemos a Maurizio Abbate (Arivis AG) por proporcionar amablemente el script de Python personalizado para el entorno Vision4D para dividir el volumen de datos en una cuadrícula de 100 × 100 µm. Además, agradecemos al Dr. Jon Daniels (Instrumentación científica aplicada) por su asesoramiento técnico y por proporcionar a la Fig. 9 el diseño óptico del ct-dSPIM. Este proyecto fue financiado parcialmente por una subvención Veni AES 2020 del programa de talentos de la fundación científica holandesa (NWO), que fue otorgada al Dr. Schueth (número de archivo: 18139). El profesor Roebroeck recibió el apoyo de una subvención inicial del ERC (MULTICONNECT, n.º 639938) y una subvención VIDI de la fundación científica holandesa (NWO) (n.º 14637).

Estos autores contribuyeron por igual: Anna Schueth, Sven Hildebrand.

Departamento de Neurociencia Cognitiva, Facultad de Psicología y Neurociencia, Universidad de Maastricht (UM), Maastricht, Países Bajos

Anna Schueth, Sven Hildebrand, Shubharthi Sengupta, Annemarie Kiessling, Michael Capalbo y Alard Roebroeck

Departamento de Patología, Centro Médico de la Universidad de Maastricht (MUMC+), Maastricht, Países Bajos

Iryna Samarska y Axel zur Hausen

Departamento de Anatomía, Universidad de Maastricht (UM), Maastricht, Países Bajos

Andreas Herrera

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AS realizó todos los experimentos de microscopía de hoja de luz, ejecutó el microscopio ct-dSPIM con mantenimiento y trabajó en el desarrollo conjunto del prototipo (junto con Applied Scientific Instrumentation, ASI, Eugen, Oregon, EE. UU.); SH realizó la preparación de la muestra, limpieza óptica y desarrolló el protocolo FFPE-MASH; SH y AS hicieron las cifras y el análisis; SS brindó asistencia con la impresión 3D de las cámaras de imágenes; AK proporcionó asistencia de laboratorio (limpieza óptica y adquisición de imágenes); AH proporcionó el tejido cerebral humano y la experiencia en anatomía humana; IS y AzH fueron los patólogos en este proyecto y proporcionaron material sobre el cáncer de próstata, experiencia en el cáncer de próstata e hicieron la calificación de puntuación de Gleason del material del paciente; AR diseñó el estudio, el desarrollo conjunto del prototipo del microscopio ct-dSPIM y realizó la supervisión; MC hizo la co-supervisión; AS, SH, AR y MC escribieron el artículo. Todos los autores leyeron, comentaron y/o editaron el artículo.

Correspondencia a Anna Schueth o Alard Roebroeck.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Ludovico Silvestri ya los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Chao Zhou y Karli Montague-Cardoso.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Schueth, A., Hildebrand, S., Samarska, I. et al. Imágenes de hoja de luz 3D eficientes de muestras de tejido de próstata y cerebro humano aclaradas ópticamente a gran escala. Comun Biol 6, 170 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04536-4

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Recibido: 26 julio 2022

Aceptado: 26 de enero de 2023

Publicado: 13 febrero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04536-4

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