Recuperación paralela de la accesibilidad a la cromatina y la dinámica de la expresión génica a partir de células T reguladoras humanas congeladas

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 5506 (2023) Citar este artículo

1369 Accesos

1 Altmetric

Detalles de métricas

Las características epigenéticas, como la accesibilidad del ADN, dictan la regulación transcripcional de una manera específica del tipo y estado de la célula, y mapear esto en salud versus enfermedad en material clínicamente relevante está abriendo la puerta a nuevos conocimientos mecánicos y nuevos objetivos para la terapia. El ensayo para la secuenciación de cromatina accesible por transposasa (ATAC-seq) permite el perfilado de accesibilidad de la cromatina a partir de una entrada de células baja, lo que lo hace manejable en poblaciones de células raras, como las células T reguladoras (Treg). Sin embargo, se sabe poco sobre la compatibilidad del ensayo con poblaciones de células raras crioconservadas. Aquí demostramos la solidez de un protocolo ATAC-seq que compara células Treg primarias recuperadas de muestras de PBMC frescas o crioconservadas, en estado estacionario y en respuesta a la estimulación. Extendemos este método para explorar la viabilidad de realizar la cuantificación simultánea de la accesibilidad de la cromatina y el transcriptoma a partir de una única alícuota de 50.000 células Treg crioconservadas. El perfilado de la accesibilidad a la cromatina y la expresión génica en paralelo dentro del mismo conjunto de controles de células para la heterogeneidad celular y es particularmente beneficioso cuando está limitado por material de entrada limitado. En general, observamos una alta correlación de los patrones de accesibilidad y la dinámica del factor de transcripción entre muestras frescas y criopreservadas. Además, se obtuvieron perfiles transcriptómicos muy similares a partir de células enteras y de los sobrenadantes recuperados de las reacciones ATAC-seq. Destacamos la viabilidad de aplicar estas técnicas para perfilar el paisaje epigenómico de las células recuperadas de biorrepositorios de criopreservación.

La expresión génica está regulada por la unión de factores de transcripción (TF) a los promotores proximales y elementos reguladores distales, como los potenciadores. La estructura de la cromatina tiene una gran influencia en la expresión génica al controlar el acceso de los TF a los sitios de unión en estos potenciadores y promotores1. Los patrones localizados de modificación epigenética de la cromatina, como la modificación de histonas, la metilación del ADN y la remodelación de nucleosomas se correlacionan con la actividad potenciadora, la unión de TF y la regulación de la transcripción. La accesibilidad a la cromatina se relaciona con el grado en que las proteínas pueden interactuar físicamente con la cromatina y está fuertemente influenciada por las modificaciones epigenéticas, el posicionamiento del nucleosoma y las proteínas de unión a la cromatina que restringen el acceso al ADN2. La cromatina más accesible o abierta se asocia con regiones transcripcionales activas y elementos reguladores, mientras que la cromatina cerrada se asocia con regiones silenciosas o reprimidas. Por ejemplo, aunque el ADN accesible constituye ~2–3% del genoma, captura más del 90% de las regiones ocupadas por los TF analizados en el proyecto ENCODE2,3,4. La accesibilidad a la cromatina generalmente se determina experimentalmente por la susceptibilidad de la cromatina a la metilación o escisión enzimática. Sin embargo, los métodos convencionales de creación de perfiles de cromatina, como DNase-seq, requieren millones de células como requisito de entrada e implican un flujo de trabajo de preparación de bibliotecas complejo. El ensayo de cromatina accesible por transposasa con secuenciación de alto rendimiento (ATAC-seq) es un enfoque relativamente nuevo en todo el genoma que analiza simultáneamente la estructura de la cromatina (accesibilidad y posicionamiento del nucleosoma) y, lo que es más importante, la unión de TF a alta resolución con un requisito de entrada más bajo que otras técnicas5,6 . El desarrollo de ATAC-seq ha hecho posible cuantificar la accesibilidad a la cromatina utilizando un número mucho menor de células, por lo que es adecuado para el entorno clínico y las poblaciones de células raras de interés. La medición de la accesibilidad de la cromatina con resolución de una sola célula también se ha hecho posible con el desarrollo de estrategias de secuenciación ATAC de una sola célula (scATAC-seq)7,8,9. En ATAC-seq, la transposasa Tn5, precargada con adaptadores de secuenciación de última generación, corta y liga simultáneamente adaptadores de secuenciación en regiones de cromatina abierta accesibles5,6. Los fragmentos capturados entre los adaptadores pueden luego amplificarse mediante PCR y someterse a una secuenciación de alto rendimiento5,6.

Los mecanismos epigenéticos gobiernan un aspecto importante de la maquinaria de expresión génica fundamental para el desarrollo y la diferenciación celular10,11. Se han informado perturbaciones epigenéticas y expresión génica alterada en muchos trastornos autoinmunitarios, como el lupus eritematoso sistémico (LES), la enfermedad inflamatoria intestinal (EII), la artritis reumatoide (AR) y la esclerosis múltiple (EM)12. La elaboración de perfiles de accesibilidad a la cromatina en cohortes de enfermedades aumentará nuestra comprensión de la desregulación de la epigenética en la autoinmunidad y ayudará en gran medida al desarrollo de la investigación traslacional y la medicina personalizada a través de la identificación de firmas epigenéticas relevantes para la enfermedad. Aunque el protocolo se aplica ampliamente en muestras recién procesadas, solo una serie de estudios han examinado el efecto de la crioconservación en la estructura de la cromatina y la expresión génica13,14,15,16,17,18,19, ninguno hasta la fecha se ha realizado en humanos primarios T subconjuntos de células que incluyen células T reguladoras FOXP3+ humanas crioconservadas (Treg). Las células T reguladoras (Treg) FOXP3+ son un subconjunto raro de linfocitos que mantienen la tolerancia inmunitaria y previenen respuestas inmunitarias inapropiadas20,21,22,23. Las alteraciones en la frecuencia y función de las células Treg se han implicado en una amplia gama de trastornos autoinmunes, incluida la diabetes tipo 1 (T1D)24, SLE25, IBD26 y RA27.

La crioconservación de células y tejidos vivos intactos es una práctica común en aplicaciones de investigación clínica y básica, lo que permite el seguimiento de pacientes o muestras a través de estados de síntomas y a lo largo del tiempo. La criopreservación se vuelve crítica en estudios de cohortes grandes donde un gran número de muestras o muchos tratamientos o puntos de tiempo impiden la genómica en muestras frescas. Dichos biorepositorios están haciendo una contribución cada vez más significativa para mejorar nuestra comprensión, diagnóstico, prevención y cura de enfermedades complejas28,29. Se han observado mejoras significativas en la recolección y el almacenamiento de muestras biológicas humanas en las últimas décadas29, lo que permite la identificación de biomarcadores de enfermedades para informar el diagnóstico y el pronóstico, así como el desarrollo de fármacos. Los biobancos se emplean cada vez más en muchos campos, incluida la autoinmunidad. Al aplicar estos enfoques genómicos de vanguardia al material del biobanco, es imperativo asegurarse de que las células recuperadas recapitulen de cerca el fenotipo de las células frescas para una interpretación precisa y una traducción clínica; sin embargo, los informes que prueban los efectos de la crioconservación en la epigenética de las células recuperadas las células son limitadas13,14.

Para que se realice un análisis multiómico de alta calidad en estos biobancos, no solo la viabilidad posterior a la descongelación y la recuperación son una métrica importante, sino que las muestras recuperadas deben reflejar fielmente el estado fisiológico y bioquímico de su estado previo a la congelación. Para probar esto, adoptamos los estándares de biobancos establecidos por el estudio Environmental Determinants of Islet Autoimmunity (ENDIA)30,31 para la crioconservación de PBMC obtenidas de sujetos humanos adultos sanos. Nuestro estudio se inició con el objetivo de evaluar el panorama global de accesibilidad a la cromatina de poblaciones de células inmunitarias raras crioconservadas, y probó la viabilidad de cuantificar la accesibilidad a la cromatina y el transcriptoma en paralelo a partir de una sola reacción de 50 000 células. Específicamente, preguntamos si la congelación antes del aislamiento de los núcleos compromete la integridad nuclear y altera la estructura de la cromatina en las células T reguladoras (Treg) FOXP3+.

Dado que las células inmunitarias necesitan responder a los estímulos ambientales, tienen programas transcripcionales altamente coordinados que impulsan la inducción de genes de respuesta inmunitaria con funciones especializadas para una respuesta inmunitaria adecuada contra los patógenos invasores y el cáncer. La desregulación de estos programas transcripcionales, por otro lado, está asociada con la autoinmunidad. La sensibilidad y la capacidad de respuesta de las células a los estímulos externos dictan de manera crítica la magnitud de la accesibilidad a la cromatina y los cambios en la expresión génica, y la alteración de esto puede ser la causa de la enfermedad. Para aplicar esto en un contexto de células inmunitarias, adoptamos Omni ATAC-seq32 porque se demostró que brinda una mejora sustancial en la calidad de los datos en múltiples aplicaciones, incluidos los materiales congelados. ATAC-seq se realizó en células Treg aisladas de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) obtenidas de sujetos humanos adultos sanos, procesadas frescas o almacenadas criogénicamente y descongeladas de acuerdo con los protocolos de biobancos publicados31. Perfilamos la accesibilidad de la cromatina y la ocupación de TF en las células Treg en estado estacionario y en respuesta a la estimulación. Demostramos que el aislamiento de núcleos intactos de muestras recién procesadas y descongeladas produjo patrones de accesibilidad a la cromatina que eran prácticamente indistinguibles entre grupos. Además, describimos un flujo de trabajo que incorpora ATAC-seq y RNA-seq para medir la accesibilidad a la cromatina y la expresión génica simultáneamente en 50 000 células, lo que permite inferir la asociación reguladora entre los dos sistemas del mismo conjunto de células. En el flujo de trabajo de ATAC-seq, después de una lisis celular suave, las fracciones nuclear y citoplasmática se separan mediante centrifugación. El núcleo se somete a ATAC-seq mientras que la fracción sobrenadante que contiene la fracción citoplasmática se somete a RNA-seq. Observamos una alta concordancia en el perfil transcriptómico entre el ARN purificado de células enteras y las fracciones de sobrenadante ATAC-seq de muestras crioconservadas, lo que indica que el perfilado paralelo de la accesibilidad a la cromatina y la expresión génica es un enfoque válido en experimentos limitados por el material de entrada. En resumen, demostramos que se puede aplicar un análisis combinado de ATAC-seq y RNA-seq a células agrupadas en biobancos, y los resultados muestran una fuerte correlación con los mismos ensayos realizados en células recién aisladas, ya sea en reposo o activadas. Esto brinda confianza al aplicar estos enfoques a las células inmunitarias almacenadas en biobancos de cohortes clínicas.

Para probar si el material congelado del biobanco refleja fielmente el material fresco, cada muestra de PBMC obtenida de un sujeto adulto humano sano se dividió por la mitad, una se procesó inmediatamente y la otra mitad se crioconservó y almacenó antes de descongelar para el aislamiento celular y ATAC-seq y RNA- experimentos secuenciales. El almacenamiento criogénico no afectó significativamente la viabilidad celular, la recuperación o la frecuencia de las células CD4+ Tconv y Treg (Fig. 1a-d). Además, el proceso de congelación preservó la complejidad de las células T, como lo demuestra el análisis de citometría de flujo (Fig. 1d), así como la preservación de los subconjuntos de células T identificados a través del análisis de incrustación de vecinos estocásticos distribuidos en t (t-SNE) (Fig. 1e, f y Fig. 1 complementaria). Se identificaron grupos de población celular bien formados en células T CD4+ frescas y descongeladas (Fig. 1c) e incluyen poblaciones que expresan firmas de células T como FOXP3, CD25, CD127, CD45RA y CCR10 (Fig. 1 complementaria). Todos estos datos demuestran que las células T aisladas del material descongelado son viables y exhiben marcadores de superficie celular similares a los de las células recién procesadas.

La complejidad de las muestras congeladas recapitula la de las muestras frescas. Viabilidad (a) y recuento absoluto de células (b) de las muestras de PBMC frescas y descongeladas. (c) Recuperación (%) de recuperación de PBMC vivas después de la descongelación. La viabilidad celular y la recuperación de las muestras de PBMC se determinaron mediante la prueba de exclusión con colorante azul tripano. (d) Perfil de citometría de flujo de una muestra representativa de PBMC frescas y descongeladas y la estrategia de selección para aislar células T convencionales (Tconv) y T reguladoras (Treg). ( e – f ) Gráficos de puntos de color que muestran eventos de células CD4 positivas frescas ( e ) y descongeladas ( f ) que contribuyen a la distribución t-SNE (incrustación de vecinos estocásticos distribuidos en t) con agrupamiento manual.

Para preguntar si el proceso de crioconservación altera el panorama de accesibilidad a la cromatina de las células T reguladoras (Treg), realizamos Omni ATAC-seq en células Treg CD4+ CD25hi CD127lo de PBMC obtenidas de sujetos humanos adultos sanos. Las muestras de PBMC se dividieron y se procesaron inmediatamente o se almacenaron criogénicamente antes del aislamiento de Treg CD4+ (Fig. 2 complementaria). Adoptamos Omni ATAC-seq ya que se sabía que brindaba una alta calidad de mapeo de lectura y complejidad de la biblioteca33 y lo confirmamos con nuestro propio análisis de identificación de picos en conjuntos de datos modelo (Figura complementaria 11). Para probar aún más la capacidad de respuesta de Treg recuperada, las células Treg aisladas se dejaron sin tratar (en reposo) o se estimularon con Dynabeads Human T-Expander CD3/CD28 durante 48 h antes de Omni ATAC-seq (Tabla complementaria 1 para la salida de secuenciación). Identificamos un promedio de 41 587 picos reproducibles para muestras frescas (en reposo), 45 534 picos reproducibles para muestras descongeladas (en reposo), 88 631 picos reproducibles para muestras frescas (estimuladas) y 95 670 picos reproducibles para muestras descongeladas (estimuladas) (Fig. 5a complementaria) . No hubo una diferencia significativa en la cantidad de picos reproducibles entre los pares de donantes en los grupos frescos y crioconservados (Figura complementaria 5b). La distribución del tamaño de los fragmentos de las bibliotecas ATAC-seq amplificadas generadas a partir de células Treg frescas y descongeladas mostró un patrón de escalera nucleosomal característico claro con una periodicidad de 200 pb, correspondiente a fragmentos de ADN de regiones libres de nucleosomas (NFR) o regiones protegidas por enteros. múltiplos de nucleosomas en fase (Fig. 2a, Figs. 3 y 4 complementarias), indicativos de bibliotecas ATAC-seq de calidad. Las células Treg descongeladas muestran una señal ATAC-seq estructurada similar alrededor de los nucleosomas que las muestras frescas (Fig. 4 complementaria) con perfiles Treg ATAC-seq frescos y descongelados que muestran un patrón distintivo en forma de V donde el vértice representa el fragmento más corto posible que está protegido por un nucleosoma (~ 117 pb). La posición más enriquecida en el gráfico V corresponde a fragmentos de 143 pb centrados en la díada del nucleosoma, que es la longitud del ADN unido por un nucleosoma canónico. Este patrón de organización de la arquitectura de la cromatina está de acuerdo con los obtenidos por Schep et al.34. Se observó un patrón de periodicidad nucleosomal más llamativo tras la estimulación en células Treg frescas y descongeladas en comparación con sus contrapartes en reposo (Fig. 4 complementaria). Esto sugiere que la estimulación da como resultado alteraciones significativas en la remodelación del nucleosoma y la accesibilidad a la cromatina. Estos resultados confirman que la congelación no interrumpió el desplazamiento y la fase de los nucleosomas a lo largo de la secuencia de ADN.

La calidad de ATAC-seq de las células Treg descongeladas recapitula de cerca la de las células frescas. ( a ) La distribución del tamaño de inserción de bibliotecas Treg ATAC-seq frescas y descongeladas. ( b ) Complejidad completa de la biblioteca y curva de rendimiento extrapolada de bibliotecas ATAC-seq frescas y descongeladas. Las medidas de complejidad se trazan frente a la complejidad más alta (100 % de lecturas mapeadas de forma única). ( c ) Distribución de la señal ATAC-seq en sitios de inicio transcripcional (TSS) de ± 1,5 kb. La cobertura de la señal se calcula a partir de lecturas por millón de lecturas asignadas para cada muestra. ( d ) Porcentaje de lecturas asignadas al genoma mitocondrial. El color más profundo se usa para representar el valor más deseable de la estadística y el rango siguiendo una escala lineal que comienza en 0 (negro) y termina en el valor máximo (amarillo). Todos los valores se determinaron a partir de la profundidad total de las lecturas alineadas. La significación estadística de la diferencia entre las muestras frescas y descongeladas se calcula mediante la prueba t de Student pareada. Los datos que se muestran en ac son representativos de las lecturas de secuenciación agrupadas de tres donantes.

Las bibliotecas frescas y descongeladas demostraron una complejidad molecular comparable (Fig. 2b) y un enriquecimiento de los sitios de inicio de la transcripción (TSS) (Fig. 2c), una medida clave de la relación señal-ruido según lo recomendado por ENCODE4, tanto en estado de reposo como estimulado. . No se observó una diferencia significativa en la proporción de lecturas mitocondriales entre las bibliotecas ATAC-seq generadas a partir de células Treg frescas y descongeladas (Fig. 2d). Tampoco observamos una diferencia significativa en la fracción de lecturas mapeadas en las regiones pico de ATAC-seq (FRiP) (Fig. 3a) o su distribución genómica (Fig. 3b) en muestras recién procesadas en comparación con muestras congeladas, lo que sugiere que la crioconservación no alteró la eficiencia de transposición en regiones de cromatina accesibles. Un aumento equivalente en las lecturas por pico después de la estimulación celular fue indicativo de que la crioconservación no afectó en gran medida los cambios en la organización de la cromatina tras la activación celular (Fig. 3a y Fig. 5a complementaria). Además, las muestras frescas y descongeladas mostraron una alta correlación de señales máximas que indican que la congelación y descongelación no tuvo un impacto apreciable en el paisaje de cromatina accesible en células estimuladas o en reposo (Fig. 3c-e, Fig. 6 complementaria). También se encontró que el paisaje de accesibilidad de la cromatina en los loci indispensables para la función y el desarrollo de Treg, como IL2RA (subunidad alfa del receptor de interleucina 2) y FOXP3 (caja de horquilla P3) (Fig. 3f, g). Juntas, estas observaciones sugieren que la crioconservación no perturba las respuestas celulares, el paisaje de cromatina y las firmas epigenéticas, y el protocolo se puede aplicar en células Treg humanas primarias crioconservadas.

La accesibilidad a la cromatina se mantiene mediante la crioconservación. ( a ) La fracción de lecturas en picos para bibliotecas Treg ATAC-seq frescas y descongeladas. La significación estadística de la diferencia entre las muestras frescas y descongeladas se calcula mediante la prueba t de Student pareada. ( b ) Distribución de picos ATAC-seq a través de características genómicas distintas expresadas en proporción de picos anotados. Los promotores se definen por la región TSS de -1 kb a +100 pb. Otros, picos anotados en 3'UTR, 5'UTR, miARN, ARN no codificante y TTS (sitio de terminación de la transcripción). ( c, d ) Gráfico de dispersión del recuento de lecturas por millón (CPM) en los picos de ATAC-seq identificados a partir de muestras frescas y descongeladas durante el reposo (c) y en respuesta a la estimulación (d). Se indica el valor del coeficiente de correlación de Pearson. (e) Correlograma que muestra la asociación de lecturas de CPM para todas las muestras ATAC-seq generadas para este estudio. ( f, g ) Perfiles de accesibilidad a la cromatina de células Treg frescas y descongeladas durante el estado de reposo y estimulado en los loci IL2RA ( f ) y FOXP3 ( g ). La señal de ATAC-seq se interseca con los superpotenciadores de células T, los estados de cromatina Treg del Proyecto de Epigenómica Roadmap y los sitios de unión de FOXP3. Cada pista ATAC-seq representa la señal agrupada de tres donantes. La vista del navegador se generó utilizando el navegador del genoma UCSC. El cálculo de ag se realizó con datos agrupados representativos de tres donantes.

Las células inmunitarias responden constantemente a los estímulos ambientales con la reprogramación de los dominios de cromatina, lo que da como resultado programas transcripcionales que impulsan la inducción de genes de respuesta inmunitaria con funciones especializadas. Las regiones genómicas específicas de estimulación de células T están enriquecidas para GWAS-eQTL o SNP asociados con enfermedades autoinmunes como la EII y la AR, así como potenciadores específicos de subconjuntos de células T, lo que enfatiza la importancia de perfilar las células inmunitarias bajo estimulación para identificar la regulación relevante para la enfermedad. elementos y mecanismos35,36. De acuerdo con estudios previos35,36, la estimulación produce un aumento global de los cambios de cromatina. Se observó una alta concordancia de los cambios de accesibilidad de la cromatina en todo el genoma y la ocupación de TF en las células Treg frescas y descongeladas en respuesta a la estimulación (Fig. 4a, Fig. 7 complementaria y Tabla complementaria 2), incluso en los genes clásicos de la firma Treg37. Extendimos este análisis para evaluar la correlación entre la señal de accesibilidad del promotor y la expresión génica correspondiente generada a partir de células Treg descongeladas utilizando RNA-seq de células completas, ya que el consenso general es que un promotor accesible es indicativo de expresión génica activa. De acuerdo con otros estudios 38,39, la correlación entre la accesibilidad del promotor y la expresión génica respectiva fue significativa (Fig. 5a y Tabla complementaria 2), lo que sugiere que la congelación no afectó la inducción del epigenoma sensible a la activación y la expresión génica en las células Treg.

Las células Treg descongeladas demuestran una actividad TF comparable a las células frescas. ATAC-seq se realizó en células Treg frescas y descongeladas en reposo clasificadas y estimuladas. ( a ) Correlación de los cambios de accesibilidad a la cromatina que responden a la estimulación en células Treg frescas y descongeladas (expresadas como cambios en las lecturas en picos entre estados de reposo y estimulados). Los loci genómicos diferencialmente accesibles entre los estados de reposo y estimulados se definieron como genes que tienen un FDR de menos de 0,05 y un cambio logarítmico que es significativamente mayor (rojo) o menor (azul) que 1,2 (equivalente a una diferencia de 2,3 veces entre condiciones) . Los picos de ATAC-seq se anotaron con el TSS más cercano y los picos accesibles diferencialmente comunes con un cambio logarítmico que es significativamente mayor/menor que 4 se anotan mediante el símbolo del gen. Los 20 principales genes distintivos Treg diferencialmente accesibles comunes (Ferraro et al. 37) están resaltados en verde. (b-d) Histograma que compara fragmentos de muestras frescas y descongeladas en los motivos de unión FOXP3 (b), CTCF, RUNX1, CREB1, GATA3, IRF1 y YY1 durante los estados de reposo (c) y estimulado (d). La señal de ocupación de TF se calcula en las huellas ATAC-seq de todo el genoma que coinciden con los motivos correspondientes obtenidos de la base de datos JASPAR. Los histogramas se generan a partir de señales de accesibilidad de cromatina Treg calculadas a partir de datos de secuenciación agrupados representativos de tres donantes.

Medición paralela de la accesibilidad de la cromatina y la dinámica del transcriptoma en células Treg humanas. RNA-seq se realizó utilizando RNA aislado de células completas o fracción sobrenadante (citoplásmica) recuperada de la reacción de ATAC-seq preparada a partir de células Treg descongeladas. ( a ) Correlación de la accesibilidad de la cromatina sensible a la estimulación y los cambios en la expresión génica en células Treg enteras descongeladas (expresadas como cambios de pliegue entre los estados de reposo y estimulados). Los genes expresados/promotor accesibles diferencialmente entre los estados de reposo y estimulados se definieron como genes que tienen un FDR de menos de 0,05 y un cambio logarítmico que es significativamente mayor o menor que 1,5. Se destacan los promotores que tienen accesibilidad diferencial a la cromatina y cambios de expresión tras la estimulación. La línea azul indica el ajuste de loess a la distribución. ( b ) Análisis diferencial de perfiles transcriptómicos generados a partir de la fracción sobrenadante (citoplasmática) de ATAC-seq y células Treg completas. Los genes expresados ​​diferencialmente se definieron como genes que tienen un FDR de menos de 0,05 y un cambio logarítmico significativamente mayor (rojo) o menor (azul) que 1,5. Los 20 principales genes diferencialmente accesibles se anotan mediante símbolos de genes. ( c ) Correlación de los perfiles transcriptómicos generados a partir de la fracción sobrenadante de ATAC-seq y las células completas. La expresión de cada gen está representada por el recuento de registros por millón (CPM) de lecturas de secuenciación. Los genes expresados ​​diferencialmente están resaltados en rojo. Los resultados mostrados son representativos de cuatro donantes.

Dentro de la cromatina accesible, las secuencias de ADN unidas al factor de transcripción (TF) son selectivamente resistentes a la escisión de Tn5, lo que da como resultado regiones cortas de ADN protegido o huellas. El análisis de la huella de Omni ATAC-seq se llevó a cabo con fragmentos accesibles agrupados que representan regiones libres de nucleosomas (NFR) y regiones unidas por un nucleosoma (1N)40. Se descubrieron un total de 551 huellas TF en nuestros datos Treg ATAC-seq (Tabla complementaria 3). Observamos huellas de TF claras y discretas en regiones accesibles identificadas a partir de nuestras células Treg frescas y descongeladas durante el estado de reposo y en respuesta a la estimulación (Fig. 4b-d). La superposición de la señal de huella amplia del genoma asociada con muestras de Treg frescas y descongeladas indicó que se observaron niveles de accesibilidad similares alrededor de las posiciones de los sitios de unión de TF previstos para una amplia gama de TF, incluido FOXP3, que es el TF maestro de las células Treg (Fig. 4b ), así como TF con funciones importantes en las células T como CTCF, RUNX1, CREB1, GATA3, IRF1 y YY1 (Fig. 4c, d). Estos datos indican claramente un paisaje de cromatina indistinguible y la ocupación de TF en regiones de cromatina abierta en células Treg frescas y descongeladas, y la congelación o el biobanco no afectaron la capacidad de resolver los patrones de accesibilidad de la ocupación de TF de un solo par de bases y no tuvieron un efecto global en TF -Interacciones del ADN.

El perfilado paralelo de la accesibilidad de la cromatina y el transcriptoma dentro del mismo grupo de células permite desentrañar la compleja relación entre los elementos reguladores y los programas de expresión génica. Este enfoque será complementario a los experimentos de una sola célula, ya que las bibliotecas utilizadas para perfilar la accesibilidad de la cromatina y el transcriptoma se derivan de la misma población de células, controlando la fluctuación genética estocástica en diferentes células de una población en un momento dado. Este flujo de trabajo es particularmente beneficioso para los experimentos limitados por material de entrada limitado, como el uso de una población de células humanas raras y criopreservadas. En el flujo de trabajo de ATAC-seq, los lisados ​​de células enteras se separan en fracciones nucleares y citoplasmáticas mediante centrifugación. Sometimos el núcleo a ATAC-seq, mientras que el ARN se aisló del componente sobrenadante y se sometió a RNA-seq. Al evaluar la viabilidad de usar ARN recuperado del sobrenadante ATAC-seq derivado del citoplasma (ATAC-SN), primero evaluamos los patrones de expresión génica global de ATAC-SN en comparación con el ARN total aislado de células Treg humanas intactas. El ATAC-SN y la fracción de células enteras exhibieron una correlación significativamente alta (R = 0,94; valor de p < 2,2 × 10–16) de la abundancia de transcritos, donde el 90,7 % (10 472 de 11 548 genes) del transcriptoma no se alteró significativamente en ambos compartimentos (Fig. 5b, c y Tabla complementaria 2). El criterio de significación se definió como una tasa de descubrimiento falso (FDR) de menos de 0,05. Estos confirman que existe un sesgo mínimo introducido por el método.

Una pequeña fracción (9,4 %) de los genes se enriqueció de manera diferencial en los compartimentos de células completas ATAC-SN derivadas del citoplasma. La mayoría de los genes que explican las diferencias en los niveles de expresión eran genes regulados a la baja en la fracción ATAC-SN. Se realizaron análisis de enriquecimiento de ontología génica (GO) para genes que eran significativamente más abundantes o agotados en la fracción ATAC-SN. Las transcripciones que estaban subrepresentadas en el ATAC-SN se asociaron con procesos biológicos nucleares y funciones moleculares, incluida la división nuclear, la modificación de histonas, la división nuclear, la organización cromosómica y la glicoproteína (Fig. 8a, c complementaria). Además, nuestros resultados también mostraron que los genes que se detectaron en niveles más bajos en el ATAC-SN con respecto a la fracción de células completas se asociaron con una estabilidad reducida del ARN en las líneas celulares linfoblastoides (LCL) HapMap humanas,41 (Fig. 9 complementaria) . Por el contrario, los transcritos que estaban enriquecidos en la fracción ATAC-SN estaban involucrados en procesos asociados a la membrana, como el direccionamiento cotraduccional de proteínas a la membrana, el direccionamiento de proteínas al retículo endoplásmico (RE), así como la traducción citoplasmática, la organización mitocondrial y el ribosoma. biogénesis (Fig. 8b, d complementaria). Estos resultados muestran una gran superposición con estudios en otros tejidos que identificaron un enriquecimiento diferencial de moléculas de ARNm en los compartimentos nuclear y citoplasmático42,43,44. Por ejemplo, se demostró en Zaghlool et al.44 que muchos ARNm de proteínas mitocondriales codificadas por el núcleo (NEMP) están significativamente enriquecidos en el compartimento citosólico en varios tipos de tejidos humanos. Para determinar si los ARNm de NEMP también se localizaron preferentemente en la fracción ATAC-SN de células T humanas, recuperamos una lista completa de genes (n = 1158) que codifican proteínas asociadas con la localización mitocondrial de Mitocharta2.045 y realizamos un análisis de enriquecimiento de genes para expresión diferencial. genes regulados hacia arriba o hacia abajo en la fracción ATAC-SN y NEMP humanos. De acuerdo con el estudio anterior, observamos una gran cantidad de transcritos de NEMP en el compartimento citosólico. Nuestros resultados muestran que un total de 71 (20,6 %) genes regulados significativamente al alza en el ATAC-SN derivado del citoplasma se superpusieron con el conjunto de datos de NEMP humanos, mientras que solo 13 (1,6 %) genes regulados a la baja en el ATAC-SN eran NEMP (Fig. 10 a). Se demostró que los NEMP estaban significativamente enriquecidos solo en la fracción ATAC-SN (valor p = 6 × 10–10) y no en extractos celulares completos (Fig. 10b complementaria), de acuerdo con que la fracción ATAC-SN se deriva principalmente del citosólico . En general, llegamos a la conclusión de que los transcriptomas derivados del ATAC-SN y las células enteras exhibieron un alto grado de concordancia (> 90 %) y que el ATAC-SN se puede utilizar para estudiar patrones de expresión génica globales a partir de recursos de entrada bajos, como poblaciones de células raras. o muestras clínicas. Nuestros hallazgos también indican que ATAC-SN conserva la localización subcelular del ARNm enriquecido citoplásmico, como lo confirma el enriquecimiento de NEMP.

Aunque se ha postulado que la crioconservación puede afectar la viabilidad y la funcionalidad de las PBMC46,47, y los ciclos repetidos de congelación y descongelación tienen un impacto negativo en la viabilidad y la función celular48, el uso de muestras frescas de grandes cohortes o estudios longitudinales plantea varios desafíos de efectos por lotes. y la biobanca los mitiga. El potencial de introducir variables de confusión en los ensayos posteriores es mayor para las muestras frescas procesadas durante un período de tiempo prolongado en comparación con las muestras crioconservadas por lotes. Además, la dependencia exclusiva de muestras frescas impide el acceso de investigaciones futuras para estudios de validación. ATAC-seq se aplica ampliamente en muestras recién procesadas y solo se ha realizado un número limitado de estudios para comparar los efectos de la crioconservación en la estructura de la cromatina13,14. En este estudio, demostramos que ATAC-seq se puede usar de manera confiable para evaluar el panorama de accesibilidad de la cromatina global de las células T reguladoras primarias (Treg) recuperadas de sangre periférica humana crioconservada, y esto probablemente sea compatible con otras células T o subtipos inmunitarios. Primero demostramos que la crioconservación no tuvo un efecto significativo sobre la viabilidad de las células T o la complejidad de la población. Usando los criterios recomendados por el consorcio ENCODE4, demostramos que las bibliotecas ATAC-seq preparadas a partir de células descongeladas proporcionaron una alta relación señal-ruido, comparable con las bibliotecas preparadas a partir de células recién procesadas. Además, observamos datos de accesibilidad a la cromatina de alta calidad en células Treg crioconservadas con respecto a la complejidad de la biblioteca, la ocupación de TF y la respuesta celular a la estimulación, que fue muy similar a los resultados obtenidos con células recién aisladas. Por último, los resultados de este estudio muestran que la señal de accesibilidad en los loci de genes y las huellas de ocupación de TF esenciales para la activación y la función de Treg se conservaron bien en las células recuperadas de la crioconservación, lo que refuerza que el proceso no interrumpió las firmas epigenéticas críticas para la regulación del transcriptoma en Células Treg. Estos hallazgos reflejan los de Scharer et al.13 y Fujiwara et al.14 en células B primarias y líneas celulares de cáncer de mama, quienes también encontraron una alta correlación de la relación señal/ruido, niveles de accesibilidad y patrones de huella TF entre muestras frescas y de biobanco. También se ha observado una alta correlación entre células frescas y congeladas en perfiles ATAC-seq de una sola célula generados a partir de muestras de PBMC49.

Si bien investigaciones anteriores se han centrado en el impacto de la congelación en la arquitectura de la cromatina de todo el genoma en células en estado estacionario, nuestros resultados se basan en esto al demostrar la accesibilidad indistinguible de la cromatina y la ocupación de TF en células T aisladas de muestras de PBMC almacenadas en biobancos en estado de reposo y, críticamente en respuesta a la estimulación celular. Se ha demostrado que la estimulación produce cambios globales a gran escala en la accesibilidad de la cromatina35,36. Se sabe que la desregulación de la homeostasis y la activación inmunitarias desempeñan un papel en el cáncer y la autoinmunidad, y cientos de variantes genéticas se han asociado con la regulación transcripcional específica de la estimulación y la expresión génica en las células T50,51. Vale la pena señalar que, en el nivel de accesibilidad de la cromatina en todo el genoma, las diferencias capturadas entre las bibliotecas Treg ATAC-seq frescas y descongeladas fueron mínimas y se detectaron cambios más apreciables al comparar el reposo con la estimulación en las muestras frescas y descongeladas ( Figuras complementarias 5 y 6). Es alentador que los resultados de este estudio también indiquen que la capacidad de respuesta a la activación de las muestras de Treg recuperadas de PBMC criopreservadas fue casi indistinguible de las muestras frescas, lo que confirma que el proceso de biobanco no comprometió la sensibilidad de las células para responder a la activación y la reprogramación epigenética de Respuestas inmunes. Es importante destacar que la accesibilidad a la cromatina de las muestras crioconservadas se correlacionó positivamente con la expresión de los genes diana. Esto proporciona información valiosa sobre las redes reguladoras, lo que no es posible solo con los perfiles transcriptómicos. En conjunto, esto confirma que las muestras del biobanco se pueden utilizar de forma fiable para identificar impulsores genéticos o epigenéticos para revelar los mecanismos de la enfermedad resultantes de la desregulación inmunitaria.

Para extender la aplicabilidad de la genómica a muestras de biobancos con un número bajo de células o a células raras en la sangre, también desarrollamos un flujo de trabajo diseñado para la elaboración de perfiles paralelos de accesibilidad a la cromatina y transcriptoma dentro de la misma población de 50 000 células. Este flujo de trabajo se diseñó para permitir experimentos limitados por material de entrada limitado, como el uso de muestras pediátricas clínicas o tipos de células poco frecuentes. En el contexto de la enfermedad, el puente entre ATAC-seq y RNA-seq no solo nos ayuda a comprender cómo se altera la epigenética, sino que proporciona información sobre los mecanismos moleculares mediante los cuales los elementos reguladores contribuyen a la patología de la enfermedad. En el protocolo ATAC-seq, tras la lisis celular, la centrifugación separa el material celular lisado en dos fracciones: 1) sedimento, que contiene núcleos intactos, que se utiliza para la transposición de Tn5 en ATAC-seq, y 2) sobrenadante, que contiene lisados ​​derivados principalmente del citoplasma y organelas no nucleares. Establecimos un protocolo para perfilar el transcriptoma del sobrenadante de lisado nuclear (''ATAC-SN'') y revelamos una alta correlación en la distribución relativa de transcripciones derivadas de ATAC-SN y extractos celulares totales en células Treg humanas primarias. Estos resultados confirman que la mayor parte del transcriptoma era congruente en ambos compartimentos y que se detectó una alta proporción de genes en cantidades similares. Aunque el análisis de transcriptoma, como RNA-seq y microarray, se ha realizado predominantemente utilizando ARN extraído de células completas, la creciente evidencia enfatiza la importancia de investigar el repertorio subcelular de moléculas de ARN y comprender la dimensión espacial que gobierna su distribución dentro de la célula52,53. 54,55. La mayoría de la fracción ATAC-SN comprende ARN citoplasmático y los estudios han demostrado que el transcriptoma citoplasmático se correlaciona fuertemente con el transcriptoma de la célula entera42,56. El ARN citoplasmático puede ser un mejor indicador de los niveles de proteína, ya que se ha sugerido que la fracción citoplasmática proporciona una representación más legítima del ARNm en estado estacionario43,57. Trask et al.43 describieron que los componentes nucleares deben excluirse, o al menos analizarse por separado de las fracciones citoplasmáticas para una cuantificación precisa y reproducible de la expresión génica. Se informó que la inclusión de ARN nuclear, que representa del 10 al 15 % del ARN total42, distorsiona el perfil de ARNm y contribuye a un nivel sustancial de falsos positivos. Ese estudio argumentó que al omitir un subconjunto de transcripciones nucleares con expresión variable o estocástica, se recuperaron genes expresados ​​​​diferencialmente que se habrían perdido o, estadísticamente no significativos utilizando las fracciones de células completas.

En general, detectamos una alta superposición de transcriptomas (90,7%; R = 0,94) dentro de las comparaciones de fracciones de células completas y ATAC-SN (FDR <0,05). Aunque representa una pequeña proporción del transcriptoma total, investigamos los impulsores de esa diferencia. En general, hubo un mayor número de genes regulados a la baja en ATAC-SN donde el núcleo está ausente, en comparación con la fracción de células completas. Una pequeña cantidad de transcripciones que se agotaron en el ATAC-SN muestran una representación excesiva de procesos biológicos y funciones moleculares asociadas con el núcleo, incluida la división nuclear, la membrana nuclear, la modificación de histonas, la organización cromosómica y la glicoproteína. Si bien esto no es sorprendente, dado que ese compartimento está técnicamente excluido, aparecerá como DE, hay procesos vinculados a estas transcripciones. La tasa de transporte del núcleo al citoplasma puede tener un impacto en el nivel de transcritos detectados en ambos compartimentos, y se informó que las moléculas de ARNm que no son de necesidad inmediata para producir proteínas se retienen en el núcleo57,58. Se ha demostrado que la transcripción en mamíferos es un proceso pulsátil que implica ráfagas estocásticas de producción de ARNm seguidas de intervalos de inactividad del promotor59 y la compartimentación del ARNm actúa para amortiguar estas fluctuaciones transcripcionales en el citoplasma y, finalmente, en los niveles de proteína58. La retención nuclear de mRNAs61 empalmados de manera incompleta60, maduros o hipereditados61 también juega un papel importante en la regulación génica, lo que permite que la célula responda rápidamente al estrés, la infección viral o los estímulos ambientales cambiantes62,63. El modelo propuesto para la retención nuclear podría explicar el modesto agotamiento de las transcripciones en la fracción ATAC-SN. Además, los transcritos con una tasa de degradación intrínsecamente alta en el citoplasma pueden detectarse en cantidades más bajas en el citoplasma que las fracciones de células completas. Asimismo, el enriquecimiento de los transcritos en la ATAC-SN con respecto a la fracción celular total podría atribuirse a su alta estabilidad en el citoplasma y bajas tasas de transcripción. Por el contrario, de acuerdo con Zaghlool et al.44, la fracción ATAC-SN derivada del citosol mostró un enriquecimiento de proteínas mitocondriales codificadas por el núcleo (NEMP). Se sabe que los ARNm de NEMP se acumulan en el citoplasma hasta que las mitocondrias requieren su traducción64 y tienen una vida media del ARNm significativamente más larga en comparación con otras transcripciones codificantes de proteínas, lo que respalda su localización preferencial y prolongada en el ATAC-SN. No obstante, nuestros datos sugieren fuertemente que la mayoría de las transcripciones exhiben igual representación de abundancia en los dos compartimentos. Nuestros resultados muestran que, a nivel global, el transcriptoma derivado de ATAC-SN recapituló de cerca el del lisado celular completo, lo que demuestra la viabilidad y confiabilidad de usar el flujo de trabajo combinado de ATAC-SN y RNAseq para una representación de alta resolución de la regulación génica y los niveles de expresión en células del biobanco. Esto indica que para la mayoría de las transcripciones, ni la localización celular selectiva ni la estabilidad del ARN perjudican su distribución dentro de la célula.

Si bien reconocemos que el tamaño modesto de la muestra puede ser una posible limitación de este estudio, demostramos una alta viabilidad y confiabilidad en el perfilado de la accesibilidad a la cromatina mediante ATAC-seq en células primarias humanas recuperadas de materiales biobancos. Estos experimentos se realizaron con 50 000 células, pero en nuestros otros estudios usamos tan solo 25 000 células y logramos resultados similares (datos no mostrados). Otra limitación es que no pudimos examinar también la reproducibilidad de estos enfoques ómicos en muestras de tejido normal debido a las implicaciones éticas del muestreo de individuos sanos, y tal vez las biopsias de tumores proporcionarían un recurso alternativo para probar esto. Sin embargo, nuestro estudio es importante ya que muestra que la crioconservación no afecta las respuestas celulares, el paisaje de cromatina y las firmas epigenéticas (señal de accesibilidad de genes y ocupación de TF) de las células Treg primarias crioconservadas, y el protocolo puede ser utilizado por grupos de investigación que trabajan con células similares. tipos de interés.

En conclusión, estos hallazgos tienen implicaciones significativas para los estudios que tienen como objetivo obtener la accesibilidad de la cromatina y el transcriptoma simultáneamente a partir de recursos con material de entrada limitado, y hasta que la profundidad, la resolución y los costos asociados con las tecnologías de celda única sean los mismos que los enfoques masivos, todavía habrá ser una necesidad de flujos de trabajo que puedan usar material biobanco y realizar descubrimientos paralelos. La aplicación de estas técnicas al material del biobanco de cohortes de enfermedades, sabiendo que los datos del material congelado reflejan con precisión las células recién aisladas, da confianza en que el hallazgo proporcionará una valiosa visión mecánica de los perfiles moleculares de la enfermedad, abriendo la puerta a nuevos objetivos terapéuticos y medicina personalizada.

Se recolectaron muestras de sangre completa con consentimiento informado de cuatro donantes adultos sanos de sexo masculino entre 36 y 57 años de edad. Las muestras no eran identificables y no se recopiló información personal como parte del estudio. Esta investigación fue aprobada por el Comité de Ética de Investigación Humana de la Red de Salud de Mujeres y Niños (WCHN-HREC) (código de aprobación: HREC/19/WCHN/65; fecha de aprobación: 11 de junio de 2019) y todos los métodos se realizaron de acuerdo con las normas pertinentes. directrices y reglamentos. Las PBMC se aislaron de sangre completa fresca obtenida de donantes adultos sanos mediante centrifugación en gradiente de densidad utilizando una solución de Ficoll-Paque. Brevemente, las muestras de sangre recolectadas en tubos que contenían heparina se diluyeron a 1 × con solución salina tamponada con fosfato y 35 ml de la muestra de sangre diluida se colocaron en capas sobre 15 ml de Ficoll-Paque™ PLUS en tubos Falcon de 50 ml, seguido de centrifugación a 800 xg. durante 20 min en un rotor de cangilones con freno desactivado. La capa de células mononucleares en la interfase se transfirió a un tubo cónico de 50 ml y se rellenó hasta un volumen final de 50 ml con PBS. Las PBMC se lavaron dos veces mediante centrifugación a 500 xga temperatura ambiente durante 10 min con el freno activado. Las PBMC se dividieron en dos grupos, la mitad para procesamiento fresco y la otra mitad para congelación/biobanco. Las muestras que se iban a congelar se resuspendieron en 1 ml de medio de congelación (FCS inactivado por calor que contenía 10 % de DMSO) a una concentración de 1 × 107 células/ml, se transfirieron a un criovial de 2 ml y se colocaron en un recipiente de congelación Mr. Frosty™ para congelación gradual a -80 °C a razón de -1 °C/minuto. A continuación, los crioviales se trasladaron a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.

Las PBMC crioconservadas se retiraron del nitrógeno líquido y se descongelaron en un baño de agua a 37 °C durante 10 min. Las PBMC descongeladas se transfirieron a un tubo cónico de 10 ml y se diluyeron con medio de cultivo completo X-VIVO 15 precalentado (medio sin suero X-VIVO 15 suplementado con HEPES 2 mM pH 7,8, L-glutamina 2 mM y 5 % de calor). suero humano inactivado) a razón de 1 mL/5 s. El tubo cónico de 10 ml que contenía la suspensión celular se invirtió suavemente para mezclar y se centrifugó a 500 xg durante 10 min a TA para un total de dos lavados. Luego, las células se resuspendieron en medio de cultivo completo X-VIVO 15 precalentado a 3–4 × 106/mL. Tras la descongelación, se permitió que las PBMC se recuperaran durante la noche en medio de cultivo X-VIVO 15 completo en una placa de cultivo de 24 pocillos antes de la FACS.

Después de reposar durante la noche en cultivo, las PBMC recién aisladas o descongeladas se lavaron en PBS suplementado con FCS al 2 % a 500 xga temperatura ambiente durante 10 min. Las células se marcaron con los siguientes anticuerpos monoclonales antihumanos conjugados con fluorocromos: anti-CD4 (BD Biosciences, BUV395 Mouse Anti-Human), anti-CD25 (BD Biosciences, BV421), anti-CD127 (BD Biosciences, PE-CF594) y colorante de viabilidad (BD Biosciences, BD Horizon Fixable Viability Stain 700) para análisis FACS. Las células Treg se aislaron como una población CD4+ CD25hi CD127dim usando un citómetro de flujo BD FACSAria Fusion. Se analizó la pureza celular de una fracción de las poblaciones aisladas mediante citometría de flujo. Después de la clasificación de las células, las células Treg se sembraron en placa a razón de 100 000 células por pocillo en una placa con fondo en U de 96 pocillos y se mantuvieron en medio de cultivo X-VIVO 15 completo (medio X-VIVO 15 suplementado con HEPES 2 mM pH 7,8, L-glutamina 2 mM). y suero humano inactivado con calor al 5 %) en presencia de IL-2 humana recombinante 500 U/ml durante 2 h a 37 °C en una incubadora con CO2 al 5 % humidificada antes de la preparación de células para los experimentos ATAC-seq y RNA-seq.

Después de una clasificación posterior de recuperación de 2 h, las células Treg se dejaron sin tratar o se estimularon con microesferas conjugadas con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 (Dynabeads Human T-Expander CD3/CD28, Gibco no. 11141D, Life Technologies) en completa X -Cultivo VIVO 15 en presencia de 500U/mL de IL-2 humana recombinante en una proporción de células/esferas de 1:1 durante 48 h. Después de 48 h, las Dynabeads se retiraron del medio de cultivo mediante separación magnética.

Las muestras frescas y descongeladas se tiñeron con los siguientes anticuerpos conjugados fluorescentes (CD25-BV421, CXCR3-BV650, CCR6-BV786, CCR10-BB515, CD127-PE-CF594, CCR4-PE-Cy7, FOXP3-AF647 (PCT), CD45RA- APC-H7) y el tinte de discriminación LIVE/DEAD-AF700. Los eventos de células T CD4+ viables (280 000) de muestras frescas (n = 4) y descongeladas (n = 4) se exportaron posteriormente para el análisis t-SNE. Los marcadores utilizados son un panel fenotípico definido diseñado para determinar distintas subpoblaciones en células T convencionales (Tconv) y T reguladoras (Treg) utilizando receptores de quimiocinas. Las células Treg se definieron a partir de la expresión de CD25+, CD127lo y FOXP3+. CD45RA se utiliza para identificar células T ingenuas (CD45RA+) y células T de memoria (CD45RA-). Los receptores de quimiocinas CXCR3, CCR4, CCR6 y CCR10 se incluyen porque se sabe que se expresan en subpoblaciones de linaje auxiliar Th1, Th2, Th17 y Th22 y se pueden encontrar en células Treg con un patrón similar. La expresión de FOXP3 se transformó de la intensidad de fluorescencia media (MFI) al porcentaje de la MFI máxima (designada "PCT") de cada archivo antes de la concatenación de archivos. El MFI de CD25, CXCR3, CCR6, CCR10, CD127, CCR4, FOXP3 (PCT), CD45RA se utilizó en el aprendizaje automático t-SNE en el conjunto de datos de eventos de células T CD4+ total (1,12 × 106). El conjunto de datos se muestreó por intervalos hasta 100 000 eventos antes de someterse a 700 iteraciones de la ecuación tSNE con la siguiente perplejidad de configuración de 50 y una aproximación de Barnes-Hut de 0,5. Los eventos sin muestrear resultantes de la reducción de muestreo se estimaron y trazaron con los 100 000 eventos (FCS express v6). Esto permite mapear eventos no muestreados a su evento muestreado más cercano para participar en el cálculo de t-SNE. Los grupos de población celular se determinaron a partir de la distribución y combinaciones de marcadores de fluorescencia.

Omni ATAC-seq se realizó como se describió anteriormente con modificaciones menores32. Brevemente, las células se pretrataron con 200 U/µL de ADNasa (Worthington) durante 30 min a 37 °C antes del experimento ATAC-seq. Los recuentos de células se realizaron manualmente con un hemocitómetro y se lisaron 50.000 células Treg en 50 µl de tampón de resuspensión frío (RSB: Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, NaCl 10 mM y MgCl2 3 mM) suplementado con NP40 al 0,1 %, Tween al 0,1 %. 20 y digitonina al 0,01 % en hielo durante 3 min. Inmediatamente después de la lisis, la reacción se lavó con 1 ml de ATAC-seq RSB que contenía Tween-20 al 0,1 % mediante centrifugación a 500 xg durante 10 min a 4 °C. Después de sedimentar los núcleos, se recogió el sobrenadante y se añadieron 3 volúmenes de reactivo TRIzol LS (Invitrogen, 10296010) al sobrenadante (dividido en cinco tubos Eppendorf de 1,5 ml) y se almacenó a -80 °C para experimentos de RNA-seq. Los núcleos se resuspendieron en 50 μl de mezcla de transposición (30 μl de tampón 2 × TD, 3,0 μl de transposasa Tn5, 16,5 μl de PBS, 0,5 μl de digitonina al 1 % y 0,5 μl de Tween-20 al 10 %). El tampón TD y la transposasa Tn5 se adquirieron de Illumina Inc. La reacción de transposición se incubó a 37 °C durante 45 min en un termomezclador con una mezcla de 1000 rpm. La reacción se purificó utilizando un kit Zymo DNA Clean & Concentrator-5 (D4014). La posterior preparación de la biblioteca ATAC-seq se realizó como se describe32. Todas las bibliotecas se amplificaron durante un total de 9 ciclos de PCR y la selección de tamaño se realizó mediante SPRIselect (Beckman Coulter) para incluir una ventana de tamaño de fragmento de 100 a 800 pb antes de la secuenciación. Las bibliotecas con códigos de barras se agruparon y secuenciaron en una plataforma de alto rendimiento Illumina NextSeq 550 de 75 ciclos emparejados hasta una profundidad de lectura promedio de 37,2 millones de lecturas (± 6 millones) por muestra (Tabla complementaria 1).

Los perfiles de RNA-seq se recolectaron de 50,000 células completas (células Treg en reposo y estimuladas) y fracciones de sobrenadante (solo células Treg estimuladas) de las reacciones de lisis Omni ATAC-seq (ATAC-SN) para 4 individuos, de los cuales 3 tienen ATAC-seq coincidente. perfiles. Las muestras se homogeneizaron con el reactivo TRIzol LS (Invitrogen, 10296010) y el ARN total se extrajo con un miRNeasy Micro Kit (Qiagen; cat# 217084). La integridad del ARN se determinó con el kit Agilent RNA 6000 Pico utilizando un bioanalizador Agilent. Se utilizaron muestras con número de integridad de ARN (RIN) > 7,5 para la secuenciación de ARNm. Las muestras de ARN se enriquecieron para ARN poli(A) utilizando el módulo de aislamiento magnético de ARNm NEBNext Poly(A) (New England Biolabs #E7490) antes de la generación de bibliotecas de ADNc utilizando un kit de preparación de bibliotecas de ARN NEBNext Ultra Directional II para Illumina (Nueva Inglaterra). Biolabs #E7760S) según el protocolo del fabricante. Las bibliotecas con códigos de barras se agruparon y secuenciaron en un secuenciador Illumina Hiseq X de 150 ciclos emparejados hasta una profundidad de lectura promedio de 37,5 millones de lecturas (± 16 millones) por muestra.

El análisis de datos de ATAC-seq utilizó las siguientes herramientas y versiones: FastQC ver. 0.11.7, Samtools ver. 1.3.1, versión Picard. 2.2.4, pajarita2 ver. 2.2.9, versión MACS2. 2.1.2, BEDTools ver. 2.25.0, bedmap ver 2.4.36, Subread ver. 1.5.2.

La calidad de los datos de secuenciación se determinó mediante FastQC (ver. 0.11.7) y luego se recortaron los adaptadores Nextera mediante cutadapt (ver. 1.14). Las lecturas recortadas se alinearon con el genoma GRCh37 usando Bowtie2 (ver. 2.2.9) con la configuración '-X 2000'. Para cada muestra, el recorte de calidad se realizó con la opción '-q 10' con lecturas no mapeadas y no primarias filtradas con la opción '-F 2828' usando Samtools ver. 1.3.1. A continuación, se filtraron las lecturas emparejadas mapeadas de forma única para excluir los duplicados de PCR utilizando Picard ver. 2.2.4. Las lecturas mitocondriales, el mapeo de lecturas a las regiones incluidas en la lista negra ENCODE hg19 (regiones con señal alta anómala en múltiples ensayos genómicos y tipos de células) y las regiones incluidas en la lista negra mitocondrial (regiones de señal alta en el genoma nuclear debido a la homología de secuencia con el genoma mitocondrial) se filtraron utilizando BEDTools versión 2.25.0. Después del filtrado, se obtuvo una mediana de 28 millones de lecturas (± 3 millones) de lecturas por muestra. Para la llamada máxima y la huella de TF, los sitios de inicio de lectura se ajustaron para representar el centro del evento de unión de la transposasa Tn5. Como la transposasa Tn5 se une como un dímero e inserta dos adaptadores separados por 9 pb65, todas las lecturas que se alinearon con la cadena directa se compensaron con + 4 pb, mientras que todas las lecturas que se alinearon con la cadena inversa se compensaron con -5 pb.

Para la accesibilidad diferencial entre las muestras de Treg en reposo y estimuladas, se concatenaron las lecturas de ATAC-seq procesadas que representan muestras frescas y congeladas de reposo o estimuladas. Los picos se llamaron desde los archivos bam combinados utilizando MACS2 ver. 2.1.266 con parámetros 'callpeak -f BAMPE -g hs -nolambda -min-length 100 -max-gap 50 -call-summits -bdg -keep-dup all -p 0.1'. Para cada conjunto de picos, los picos superpuestos se fusionaron utilizando BEDTools ver. 2.25.0 y el número de lecturas en cada mapeo individual de muestra/donante para cada pico se calculó utilizando featureCounts67, considerando solo fragmentos con ambos extremos alineados con éxito (-B) y con lecturas que se superponen a múltiples funciones asignadas a la función con la mayor superposición ( -superposición más grande). Luego, los datos de conteo se importaron a R y se procesaron con edgeR68, eliminando cualquier pico que tuviera menos de 3 conteos por millón en más de tres muestras. Los recuentos se normalizaron para el tamaño de la biblioteca de muestras y se calcularon las dispersiones comunes, de tendencias y de etiquetas. El análisis de accesibilidad diferencial se realizó utilizando voom del paquete limma69. La accesibilidad diferencial significativa se definió como regiones que tienen un FDR de Benjamini-Hochberg por debajo de 0,05 y un cambio de pliegue superior a 1,5. IGV ver. 2.5.2 (Broad Institute) y el navegador de genoma UCSC (Universidad de California Santa Cruz) se utilizaron para la visualización de pistas ATAC y RNA-seq. Los picos se anotaron en el TSS más cercano utilizando ChIPpeakAnno70. HINT-ATAC40 se usó para llamar huellas debajo de los picos ATAC-seq de los datos ATAC-seq con parámetros '-atac-seq -paired-end -organism = hg19'.

Todas las muestras de RNA-seq se validaron primero para una calidad constante mediante FastQC v0.11.7 (Instituto Babraham) utilizando parámetros predeterminados. Las lecturas sin procesar se recortaron para eliminar adaptadores y bases de baja calidad utilizando AdapterRemoval/2.2.1 con parámetros '-minquality 30 -minlength 50'. Las lecturas recortadas con adaptador y calidad se pseudoalinearon posteriormente con el genoma humano GRCh38 usando Kallisto con los parámetros '-b 50 y -fr-stranded'. Brevemente, se importaron recuentos sin procesar y se filtraron para eliminar genes con expresión baja o nula (menos de dos recuentos por millón en todos los grupos experimentales). La expresión diferencial se calculó utilizando voom del paquete limma69, y los genes que tienen una tasa de descubrimiento falso (FDR) de Benjamini-Hochberg inferior a 0,05 y un cambio de pliegue superior a 1,5 se consideran significativos (a menos que se indique lo contrario). Los datos se visualizaron utilizando ggplot2 (ver. 3.0.0).

Los conjuntos de datos generados y analizados durante el estudio actual están disponibles en el repositorio del Archivo Europeo de Nucleótidos (ENA) con el código de acceso PRJEB55015.

Brown, CY et al. Conocimientos moleculares sobre la adaptación de las células T reguladoras a los tejidos propios, ambientales y del huésped: plasticidad o pérdida de función en enfermedades autoinmunes. Frente. inmunol. 11, 1269 (2020).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Klemm, SL, Shipony, Z. & Greenleaf, WJ Accesibilidad a la cromatina y el epigenoma regulador. Nat. Rev. Genet. 20(4), 207–220 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Thurman, RE y col. El paisaje de cromatina accesible del genoma humano. Naturaleza 489 (7414), 75–82 (2012).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Dunham, I. et al. Una enciclopedia integrada de elementos de ADN en el genoma humano. Naturaleza 489 (7414), 57–74 (2012).

Artículo ADS CAS Google Académico

Buenrostro, JD et al. ATAC-seq: un método para analizar la accesibilidad de la cromatina en todo el genoma. actual Protocolo mol. Biol. 109, 21–29 (2015).

Artículo PubMed Central Google Académico

Buenrostro, JD et al. Transposición de cromatina nativa para perfiles epigenómicos rápidos y sensibles de cromatina abierta, proteínas de unión a ADN y posición de nucleosomas. Nat. metanfetamina 10(12), 1213–1218 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Cusanovich, DA et al. Perfiles multiplex de células individuales de accesibilidad de la cromatina mediante indexación celular combinatoria. Science (Nueva York, NY) 348(6237), 910–914 (2015).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Buenrostro, JD et al. La accesibilidad de la cromatina unicelular revela principios de variación regulatoria. Naturaleza 523 (7561), 486–490 (2015).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Massarat, AR et al. Descubrimiento de variantes de un solo nucleótido e indeles de ATAC-seq a granel y de una sola célula. Ácidos Nucleicos Res. 49(14), 7986–7994 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Moore, LD, Le, T. & Fan, G. Metilación del ADN y su función básica. Neuropsicofarmacología 38(1), 23–38 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Gibney, ER & Nolan, CM Epigenética y expresión génica. Herencia 105(1), 4–13 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Ahmadi, M. et al. Modificaciones epigenéticas e implementaciones de medicamentos basados ​​en la epigenética de enfermedades autoinmunes. biomedicina Farmacéutico. 87, 596–608 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Scharer, CD et al. ATAC-seq en muestras de biobancos define una estructura única de accesibilidad a la cromatina en células B de SLE ingenuas. ciencia Rep. 6, 27030 (2016).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fujiwara, S. et al. Datos ATAC-seq de alta calidad recuperados de líneas celulares y tejidos de mama criopreservados. ciencia Rep. 9(1), 516–516 (2019).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Milani, P. et al. Protocolo de congelación de células adecuado para ATAC-Seq en neuronas motoras derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos. ciencia Rep. 6, 25474 (2016).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Halstead, MM et al. Alteración sistemática de ATAC-seq para perfilar cromatina abierta en preparaciones de núcleos crioconservados de tejidos de ganado. ciencia Rep. 10(1), 5230 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Barwick, BG et al. La accesibilidad a la cromatina identifica los elementos reguladores que predicen la expresión génica y el resultado de la enfermedad en el mieloma múltiple. clin. Cáncer Res. 27(11), 3178–3189 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shannon, J. et al. Análisis de accesibilidad a la cromatina de folículos ováricos humanos frescos y crioconservados. mol. Tararear. reprod. 28(6), gaac020 (2022).

Artículo Google Académico

Rocas, D. et al. Análisis de accesibilidad de la cromatina específica del tipo de célula en el ratón y el cerebro humano. Epigenética 17(2), 202–219 (2022).

Artículo MathSciNet PubMed Google Académico

Cretney, E., Kallies, A. & Nutt, SL Diferenciación y función de las células T reguladoras efectoras Foxp3. Tendencias Immunol. 34(2), 74–80 (2012).

Artículo PubMed Google Académico

Grzanka, J. et al. FoxP3, Helios y SATB1: roles y relaciones en las células T reguladoras. En t. inmunofarmaco. 16(3), 343–347 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Fu, W. et al. Un interruptor genético redundante múltiple "bloquea" la firma transcripcional de las células T reguladoras. Nat. inmunol. 13(10), 972–980 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mills, KHG Células T reguladoras: ¿aliadas o enemigas en la inmunidad a la infección?. Nat. Rev. Inmunol. 4(11), 841–855 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Aghili, B. et al. Función supresora alterada de las células T reguladoras en la diabetes tipo 1. Irán. J. Immunol. 12(4), 240–251 (2015).

MathSciNet PubMed Google Académico

Ohl, K. & Tenbrock, K. Células T reguladoras en el lupus eritematoso sistémico. EUR. J. Immunol. 45(2), 344–355 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Hori, S., Nomura, T. & Sakaguchi, S. Control del desarrollo de células T reguladoras por el factor de transcripción Foxp3. Ciencia 299 (5609), 1057–1061 (2003).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Alzabin, S. & Williams, RO Células T efectoras en la artritis reumatoide: lecciones de modelos animales. FEBS Lett. 585(23), 3649–3659 (2011).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Salud, Directrices GOWADO para biobancos humanos, bases de datos de investigación genética y datos asociados. 2010; Disponible en: http://www.health.wa.gov.au/circularsnew/circular.cfm?Circ_ID=12748.

Coppola, L. et al. Biobancos en el cuidado de la salud: Evolución y direcciones futuras. J. traducción Medicina. 17(1), 172 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Penno, MAS et al. Determinantes ambientales de la autoinmunidad de los islotes (ENDIA): un estudio de cohortes desde el embarazo hasta los primeros años de vida en niños con riesgo de diabetes tipo 1. BMC Pediatría. 13(1), 124 (2013).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Esperanza, CM et al. Optimización del manejo de sangre y criopreservación de células mononucleares de sangre periférica de muestras con bajo número de células. En t. J. Mol. ciencia 22(17), 9129 (2021).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Corcés, MR et al. Un protocolo ATAC-seq mejorado reduce el fondo y permite el interrogatorio de tejidos congelados. Nat. Métodos 14, 959 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Corcés, MR et al. Un protocolo ATAC-seq mejorado reduce el fondo y permite el interrogatorio de tejidos congelados. Nat Meth 14(10), 959–962 (2017).

Artículo CAS Google Académico

Schep, AN et al. Las huellas dactilares de nucleosomas estructurados permiten el mapeo de alta resolución de la arquitectura de la cromatina dentro de las regiones reguladoras. Genoma Res. 25(11), 1757–1770 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Puerta, RE et al. Determinantes genéticos de regiones de cromatina coaccesibles en células T activadas en humanos. Nat. Gineta. 50(8), 1140–1150 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Calderón, D. et al. Panorama de la cromatina sensible a la estimulación en diversas células inmunitarias humanas. Nat. Gineta. 51(10), 1494–1505 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ferraro, A. et al. Variación interindividual en células T reguladoras humanas. proc. nacional Academia ciencia 111(12), E1111–E1120 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Starks, RR et al. El análisis combinado de accesibilidad de promotores disímiles y perfiles de expresión génica identifica genes específicos de tejido y redes reprimidas activamente. epigeneto. Cromatina 12(1), 16 (2019).

Artículo Google Académico

Reske, JJ, Wilson, MR & Chandler, RL El método de normalización ATAC-seq puede afectar significativamente el análisis y la interpretación de la accesibilidad diferencial. epigeneto. Cromatina 13(1), 22 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Li, Z. et al. Identificación de sitios de unión de factores de transcripción utilizando ATAC-seq. Genoma Biol. 20(1), 45 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Duan, J. et al. Encuesta de todo el genoma de las diferencias interindividuales de la estabilidad del ARN en líneas celulares linfoblastoides humanas. ciencia Rep. 3(1), 1318 (2013).

Artículo ADS MathSciNet PubMed PubMed Central Google Scholar

Barthelson, RA et al. Comparación de las contribuciones de los compartimentos nuclear y citoplasmático a la expresión génica global en células humanas. BMC Genomics 8(1), 340 (2007).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Trask, HW et al. El análisis de micromatrices de ARN citoplásmico frente a células enteras revela un número considerable de ARNm falsos positivos y perdidos. ARN 15 (10), 1917-1928 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zaghlool, A. et al. La caracterización de los transcriptomas nucleares y citosólicos en el tejido cerebral humano revela nuevos conocimientos sobre la distribución subcelular de las transcripciones de ARN. ciencia Rep. 11(1), 4076 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Calvo, SE, Clauser, KR & Mootha, VK MitoCarta20: Un inventario actualizado de proteínas mitocondriales de mamíferos. Ácidos Nucleicos Res. 44(D1), D1251-7 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Trück, J. et al. Efecto de la crioconservación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) sobre la variabilidad de un ELISpot de células B de memoria específico de antígeno. Tararear. vacuna Inmunotro. 10(8), 2490–2496 (2014).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Weinberg, A. et al. Optimización y limitaciones del uso de células mononucleares de sangre periférica crioconservadas para la caracterización funcional y fenotípica de células T. clin. Vacuna Immunol. CVI 16(8), 1176–1186 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Serra, V. et al. Cuantificación de los efectos perjudiciales de múltiples ciclos de congelación/descongelación en la supervivencia y función de los linfocitos humanos primarios. En t. J. Mol. ciencia https://doi.org/10.3390/ijms24010634 (2023).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Satpatía, AT et al. Paisajes de cromatina unicelular masivamente paralelos del desarrollo de células inmunitarias humanas y el agotamiento de células T intratumorales. Nat. Biotecnología. 37(8), 925–936 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schmiedel, BJ y col. Impacto de los polimorfismos genéticos en la expresión génica de las células inmunitarias humanas. Celda 175(6), 1701-1715.e16 (2018).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ye, CJ et al. Intersección de la variación de la población y la genética de la autoinmunidad en la activación de las células T humanas. Ciencia 345(6202), 1254665 (2014).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Taliaferro, JM, Wang, ET & Burge, CB Análisis genómico de localización de ARN. ARN Biol. 11(8), 1040–1050 (2014).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Martin, KC & Ephrussi, A. localización de ARNm: expresión génica en la dimensión espacial. Celda 136(4), 719–730 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kuersten, S. & Goodwin, EB El poder del 3' UTR: control y desarrollo traslacional. Nat. Rev. Genet. 4(8), 626–637 (2003).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Zhang, T. et al. RNALocate: un recurso para las localizaciones subcelulares de ARN. Ácidos Nucleicos Res. 45(D1), D135–D138 (2017).

ANUNCIOS CAS PubMed Google Académico

Pastro, L. et al. La compartimentación nuclear contribuye al control de la expresión génica específica de la etapa en Trypanosoma cruzi. Frente. Desarrollo celular Biol. 5, 8 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Solnestam, BW et al. La comparación del ARNm total y citoplasmático revela una regulación global por retención nuclear y miARN. BMC Genomics 13, 574–574 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bahar Halpern, K. et al. Retención nuclear de ARNm en tejidos de mamíferos. Rep. Celular 13(12), 2653–2662 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Darzacq, X. et al. Dinámica in vivo de la transcripción de la ARN polimerasa II. Nat. Estructura. mol. Biol. 14(9), 796–806 (2007).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Boutz, PL, Bhutkar, A. y Sharp, PA Los intrones detenidos son una nueva clase extendida de intrones empalmados postranscripcionalmente. Genes Dev. 29(1), 63–80 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Chen, LL & Carmichael, GG Retención nuclear alterada de ARNm que contienen repeticiones invertidas en células madre embrionarias humanas: papel funcional de un ARN nuclear no codificante. mol. Celúla. 35(4), 467–478 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Prasanth, KV et al. Regulación de la expresión génica a través de la retención nuclear de ARN. Celda 123(2), 249–263 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Miyamoto, Y. et al. Las tensiones celulares inducen la acumulación nuclear de importina alfa y provocan un bloqueo de importación nuclear convencional. J. Cell Biol. 165(5), 617–623 (2004).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Couvillion, MT y col. Programas de traducción mitocondrial y citosólica sincronizados. Naturaleza 533(7604), 499–503 (2016).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Adey, A. et al. Construcción rápida, de bajo aporte y bajo sesgo de bibliotecas de fragmentos de escopeta mediante transposición in vitro de alta densidad. Genoma Biol. 11(12), R119–R119 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gaspar, J., Llamadas pico mejoradas con MACS2. 2018.

Liao, Y., Smyth, GK & Shi, W. featureCounts: un programa eficiente de propósito general para asignar lecturas de secuencias a características genómicas. Bioinformática 30(7), 923–930 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Robinson, MD, McCarthy, DJ y Smyth, GK edgeR: un paquete de bioconductores para el análisis de expresión diferencial de datos de expresión génica digital. Bioinformática (Oxford, Inglaterra) 26(1), 139–140 (2010).

CAS PubMed Google Académico

Ley, CW et al. Voom: los pesos de precisión desbloquean herramientas de análisis de modelos lineales para recuentos de lectura de RNA-seq. Genoma Biol. 15(2), R29 (2014).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Zhu, LJ et al. ChIPpeakAnno: un paquete de bioconductores para anotar datos de ChIP-seq y ChIP-chip. BMC Bioinforme. 11(1), 237 (2010).

Artículo Google Académico

Descargar referencias

Agradecemos a Benjamin Ramoso, Alison Gwiazdzinski y Sarah Beresford (Estudio ENDIA, WCH) por su ayuda en la recolección de sangre. Nos gustaría agradecer a todos los voluntarios que dieron su consentimiento para donar sangre para este estudio. Agradecemos al Dr. Randall Grose (SAHMRI Research and Core Facilities) por su experiencia en aislamiento celular y citometría de flujo, al Dr. Stephen Wilcox (WEHI Genomics Hub) y a Genewiz por la secuenciación de Illumina. También agradecemos al Dr. Kristian Handler (DZNE) y al Dr. Simone Picelli (IOB) por su experiencia y asesoramiento para mejorar los procedimientos experimentales para la preparación y secuenciación de bibliotecas ATAC-seq. Parte de este trabajo fue apoyado por el Estudio de Determinantes Ambientales de la Autoinmunidad de los Islotes (ENDIA). El Estudio ENDIA fue apoyado por JDRF Australia, el beneficiario de la subvención de la Mancomunidad de Australia para Investigación Acelerada bajo el Fondo de Futuro de Investigación Médica, y con fondos de The Leona M. and Harry B. Helmsley Charitable Trust (subvención # 3-SRA-2020 -966-MN). Además, parte de esta subvención también fue financiada por una subvención de la Fundación de Investigación del Hospital de Mujeres y Niños (Sadlon and Barry).

Instituto de Investigación Robinson, Universidad de Adelaide, Adelaide, Australia

Ying Y. Wong, Jessica E. Harbison, Christopher M. Hope, Batjargal Gundsambuu, Katherine A. Brown, Soon W. Wong, Cheryl Y Brown, Jennifer J. Couper, Jimmy Breen, Ning Liu, Stephen M. Pederson, Timothy Sadlon y Simón C. Barry

Centro Alemán de Enfermedades Neurodegenerativas, Universidad de Bonn, Bonn, Alemania

Maren Köhne, Kathrin Klee, Joachim Schultze y Marc Beyer

Hospital de Mujeres y Niños, North Adelaide, Australia

Jessica E. Harbison, Christopher M. Hope, Cheryl Y Brown, Jennifer J. Couper, Timothy Sadlon y Simon C. Barry

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

YYW contribuyó a la adquisición, interpretación de datos NGS y redacción del manuscrito. CMH contribuyó a la adquisición e interpretación de datos de fenotipado de células inmunitarias por citometría de flujo. JEH y JJC contribuyeron a la metodología de biobancos. BG y CB contribuyeron a la metodología de cultivo celular y la interpretación de los datos. YYW realizó el análisis de datos con la asistencia y orientación de JB, NL, SMP y SWWKAB contribuyeron a la revisión del manuscrito. MB, JS, MK y KK brindaron capacitación en preparación de bibliotecas ATAC-seq y análisis de datos. TS y SCB supervisó los experimentos y contribuyó a la interpretación de datos y revisión crítica del manuscrito. SCB dirigió el proyecto, la adquisición de fondos y otros recursos.

Correspondencia a Simon C. Barry.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Wong, YY, Harbison, JE, Hope, CM et al. Recuperación paralela de la accesibilidad a la cromatina y la dinámica de la expresión génica a partir de células T reguladoras humanas congeladas. Informe científico 13, 5506 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-32256-6

Descargar cita

Recibido: 15 julio 2022

Aceptado: 24 de marzo de 2023

Publicado: 04 abril 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-32256-6

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y Pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.