La ablación Peli3 mejora el paracetamol

Medicina experimental y molecular (2023)Citar este artículo

160 Accesos

Detalles de métricas

Las vías de señalización que gobiernan la lesión hepática inducida por paracetamol (APAP) se han estudiado ampliamente. Sin embargo, se sabe poco sobre las enzimas modificadoras de ubiquitina necesarias para la regulación de la lesión hepática inducida por APAP. Aquí, examinamos si la proteína Pellino3, que tiene actividad de ligasa E3, es necesaria para la lesión hepática inducida por APAP y, posteriormente, exploramos su mecanismo molecular. Los ratones de cuerpo entero Peli3-/- knockout (KO) y Peli3 knockdown (KD) mediado por adenovirus mostraron niveles reducidos de muerte de células centrolobulillares, infiltración de células inmunitarias y biomarcadores de daño hepático, como alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST), tras el tratamiento con APAP en comparación con ratones de tipo salvaje (WT). La deficiencia de Peli3 en los hepatocitos primarios disminuyó el daño mitocondrial y lisosomal y redujo los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) mitocondriales. Además, los niveles de fosforilación en la serina 9 en el citoplasma y la translocación mitocondrial de GSK3β disminuyeron en hepatocitos primarios obtenidos de ratones Peli3-/- KO, y estas reducciones estuvieron acompañadas por disminuciones en la fosforilación de JNK y la translocación mitocondrial. Pellino3 se unió más fuertemente a GSK3β en comparación con JNK1 y JNK2 e indujo la poliubiquitinación de GSK3β mediada por lisina 63 (K63). En experimentos de rescate, la expresión ectópica de Pellino3 de tipo salvaje en hepatocitos Peli3-/- KO restauró la translocación mitocondrial de GSK3β, pero esta restauración no se obtuvo con la expresión de un mutante catalíticamente inactivo de Pellino3. Estos hallazgos son los primeros en sugerir un vínculo mecánico entre Pellino3 y la lesión hepática inducida por APAP a través de la modulación de la poliubiquitinación de GSK3β.

El paracetamol (N-acetil-p-aminofenol; APAP) es un fármaco analgésico y antipirético suave de uso común en todo el mundo. Sin embargo, la sobredosis de APAP puede causar daño hepático grave que progresa a insuficiencia hepática aguda y muerte, aunque se reconoce que APAP es seguro en dosis terapéuticas adecuadas1. Una gran cantidad de evidencia acumulada en las últimas décadas apunta a la acumulación de N-acetil-p-benzoquinona imina (NAPQI), el metabolito reactivo y tóxico de APAP, como la principal causa de daño hepático inducido por sobredosis de APAP2. Aunque pequeñas cantidades de NAPQI, que se metaboliza a partir de APAP por el citocromo hepático P450 2E1 (CYP2E1), pueden desintoxicarse mediante la conjugación de glutatión (GSH), la formación excesiva de NAPQI después de una sobredosis de APAP agota rápidamente el GSH hepático y, por lo tanto, provoca la formación de aductos proteicos. particularmente en proteínas mitocondriales3,4. Esta formación de aductos de proteínas mitocondriales induce una generación excesiva de superóxido mitocondrial, que puede reaccionar con el óxido nítrico (NO) para producir peroxinitrito y, por lo tanto, interfiere con la función de las proteínas a través de la nitración de los residuos de proteína tirosina5,6. La protección contra la hepatoxicidad inducida por APAP por el mimético de la superóxido dismutasa (SOD) Mito-TEMPO, junto con el aumento de lesiones en ratones con deficiencia parcial de SOD, enfatiza la importancia del superóxido en este proceso7,8,9. Además, varios estudios de daño hepático inducido por APAP indican que la óxido nítrico sintasa neuronal (nNOS) está involucrada en la elevación de NO10,11,12. Estos cambios mitocondriales en la hepatotoxicidad por APAP, como el estrés oxidativo severo y el estrés nitrosativo, contribuyen a la apertura de los poros de transición de la permeabilidad mitocondrial, lo que conduce a la pérdida del potencial de la membrana mitocondrial y a la liberación de endonucleasas que causan daño en el ADN13. Todos estos eventos finalmente resultan en necrosis hepatocelular, aunque estudios recientes también han sugerido la importancia de la necroptosis14,15,16,17,18. La muerte celular necrótica en la hepatotoxicidad por APAP libera patrones moleculares asociados al daño (DAMP), que incluyen ADN mitocondrial, fragmentos de ADN nuclear, proteína del grupo de alta movilidad 1 (HMGB1) y ATP, lo que da como resultado una inflamación estéril19,20. Estos DAMP activan la señalización del inflamasoma al unirse a los receptores de reconocimiento de patrones (PRR) y promueven el procesamiento de pro-caspasa-1, lo que da como resultado el procesamiento posterior de pro-IL-1β o pro-IL-18 en citocinas activas21. Estas citocinas parecen ser responsables de la activación y el reclutamiento de neutrófilos y macrófagos derivados de monocitos en el hígado, aunque sigue siendo controvertido si estas células inflamatorias agravan la lesión hepática o facilitan la regeneración19. Además de estos procesos, se ha informado que la autofagia juega un papel importante para facilitar la recuperación y regeneración del hígado22,23,24.

A pesar de los extensos estudios fisiopatológicos sobre la lesión hepática y los metabolitos reactivos generados por la sobredosis de APAP, es probable que las vías de señalización que gobiernan esta hepatotoxicidad sean más complicadas que nuestro conocimiento actual. Numerosos estudios han demostrado principalmente un papel perjudicial de la quinasa N-terminal c-Jun (JNK), una proteína quinasa de serina/treonina que pertenece a la superfamilia de proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK), en la hepatotoxicidad inducida por APAP25,26,27, 28,29,30. Se cree que esta activación sostenida de JNK en el citosol y su translocación mitocondrial durante la sobredosis de APAP amplifica el estrés mitocondrial y nitrosativo mediado por APAP31.

En la hepatotoxicidad mediada por APAP, se ha informado que la activación de JNK está modulada por proteínas de señalización aguas arriba como GSK3β, MLK3 y ASK132,33,34. Sin embargo, informes recientes también indican que la proteína quinasa C (PKC) y la proteína quinasa 1 que interactúa con el receptor (RIPK1) participan en la hepatotoxicidad de APAP a través de la activación de JNK35,36. Entre estas quinasas, se sabe que GSK3β es un mediador importante involucrado en la hepatotoxicidad mediada por APAP a través de su translocación a las mitocondrias, así como la activación de JNK32.

A pesar del conocimiento actual sobre las vías de señalización involucradas en la hepatotoxicidad por APAP, los sistemas modificadores de ubiquitina en la lesión hepática mediada por APAP son menos conocidos que la fosforilación de los componentes de señalización. Se ha descubierto que la ubiquitinación de proteínas diana es crucial para diversos procesos celulares, como la estabilidad de proteínas, la transducción de señales, la endocitosis y el tráfico, y esta modificación versátil está mediada principalmente por las ubiquitina ligasas E337. La proteína Pellino3, codificada por el gen Peli3, es miembro de la familia Pellino compuesta por Pellino1, Pellino2 y Pellino338. Pellino3 tiene un dominio RING con actividad de ligasa E3 y está involucrado en diversas vías de señalización inflamatoria, como la señalización del receptor tipo Toll, la señalización de NOD2 y las vías de señalización de TNF39,40,41,42. Curiosamente, se ha descubierto que la sobreexpresión de proteínas Pellino3 facilita la activación de MAPK como JNK y p3843,44. Estos resultados sugieren fuertemente un posible papel de Pellino3 en la hepatotoxicidad mediada por APAP, que no se ha abordado hasta ahora.

En este estudio, demostramos un papel de la proteína Pellino3 en la hepatotoxicidad mediada por APAP a través de su participación en la translocación mitocondrial y la fosforilación de GSK3β mediante el uso de eliminación de Peli3-/- de cuerpo entero (KO) y eliminación de Peli3 mediada por adenovirus ( KD) modelos de ratón. Este informe proporciona la primera identificación de una ubiquitina ligasa E3 que modula la función de GSK3β en la lesión hepática mediada por APAP.

Para generar ratones Peli3-/- KO, se construyó un vector de inactivación condicional dirigido al gen Peli3 utilizando un sistema de recombinación45 (Fig. 1a complementaria). Se insertó un fragmento de ADN genómico de 5,9 kb que contenía el exón 2 de Peli3 en el plásmido pLMJ235. La secuencia loxP y el casete frt-loxP-Neo-frt-loxP, que tiene un marcador de selección positivo (gen de resistencia a la neomicina), se insertaron 117 pb aguas arriba y 304 pb aguas abajo del exón 2, respectivamente. El vector de direccionamiento linealizado contra el gen Peli3 se electroporó inicialmente en 2 × 107 J1 ESC de ratón. Se seleccionaron al azar aproximadamente trescientas colonias resistentes a G418 y 1-(2-desoxi-2-fluoro-1-β-D-arabinofuranosil)-5-yodouracilo (FIAU), y estos clones se seleccionaron mediante análisis genómicos de transferencia Southern utilizando sondas externas. Se inyectaron ESC dirigidas en blastocistos de la cepa C57BL/6 (B6). El cultivo de ESC y las inyecciones de blastocisto se realizaron usando métodos estándar. Las quimeras macho se cruzaron con hembras B6 para establecer la cepa Peli3+/3f en un fondo híbrido 129/B6. Se cruzaron ratones Peli3+/3f con ratones β-actina-Cre para generar una cepa de ratón con el alelo nulo 46 de Peli31f, en el que se eliminó el exón 2. Para generar ratones Peli3 KO con antecedentes C57BL/6, se retrocruzaron ratones Peli3 KO con antecedentes híbridos con ratones C57BL/6 durante más de diez generaciones. Los genotipos de ratones de tipo salvaje y Peli3-/- KO se analizaron mediante PCR utilizando los cebadores indicados (Fig. 1b complementaria). La expresión del ARNm de Peli3 en ratones Peli3-/- KO también se confirmó mediante RT‒PCR cuantitativa en tiempo real (qRT‒PCR) con los cebadores descritos en la Tabla complementaria 1.

Se adquirieron células de riñón embrionario humano 293 (HEK293) de American Type Culture Collection (Manassas, VA, EE. UU.). Las células HEK293 se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) con suero fetal bovino al 10% (FBS; Thermo Fisher Scientific), 10 unidades/ml de penicilina y 10 mg/ml de estreptomicina (Thermo Fisher Scientific). Científico). Las células HEK293 se analizaron de forma rutinaria para la contaminación por micoplasma mediante PCR. Se incubaron hepatocitos primarios de ratón en medio M199 (Sigma-Aldrich) con FBS al 10 %, penicilina 10 unidades/ml, estreptomicina 10 mg/ml, HEPES 23 mM y dexametasona 10 nM (Sigma-Aldrich). El acetaminofén (APAP) se adquirió de Sigma-Aldrich. Los plásmidos se transfectaron transitoriamente en células HEK293 usando polietilenimina (PEI). Se utilizó Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) para la transfección en células de hepatocitos primarios de ratón.

Se usaron ratones Peli3-/- KO machos (8–9 semanas de edad) y sus compañeros de camada de tipo salvaje para los experimentos generales, se alojaron en una instalación libre de patógenos, mantuvieron un ritmo de reloj circadiano de 12 h/12 ​​h y se alimentaron comida estándar. Para establecer un modelo de daño hepático inducido por APAP, se administró por vía oral 500 mg/kg de APAP a ratones que habían estado en ayunas durante 14 h en presencia de agua sin solo alimentos. Previo a su administración, APAP se disolvió en agua destilada a 55 °C y se enfrió a 37 °C. Como control, se administró oralmente agua destilada a los ratones. Tras la administración de APAP, se controló la supervivencia de los ratones en los tiempos indicados. Se recogieron tejido hepático y suero sanguíneo 24 h después del tratamiento con APAP para experimentos adicionales. La construcción de adenovirus recombinantes que expresan un control de ARNi no específico (shCON) y ARNsh específicos de Peli3 (shPeli3 #3 y shPeli3 #4) y los experimentos con animales relacionados se realizaron como se describió anteriormente47. Las secuencias de ARNi específicas contra el ARNm de Peli3 endógeno utilizado en los adenovirus recombinantes se describen en la Tabla complementaria 2. Este estudio fue revisado y aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Facultad de Medicina de la Universidad Sungkyunkwan (SUSM), que es un Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC International) es una instalación acreditada y cumple con las pautas del Instituto de Recursos de Animales de Laboratorio (ILAR). En todos los experimentos con animales, los ratones se seleccionaron al azar para generar el modelo de daño hepático inducido por APAP.

Los plásmidos de expresión Pellino3a y Pellino3b humanos marcados con HA se describieron previamente48. Usando HA-hPellino3a y HA-hPellino3b como plantillas para la PCR con cebadores específicos, los ADNc de Pellino3a y Pellino3b se subclonaron en los sitios EcoRI y XhoI del vector pcDNA-Flag (Thermo Fisher Scientific) o los sitios XhoI y KpnI del pCS3+MTBX vector, que fue amablemente proporcionado por el Dr. CY Choi (Universidad Sungkyunkwan, Corea), y este proceso produjo Flag-hPellino3a y Flag-hPellino3b y 6xMyc-hPellino3a y 6xMyc-hPellino3b, respectivamente. El ADNc de Pellino3 de ratón de longitud completa se amplificó a partir de hepatocitos primarios de ratón y se subclonó en los sitios EcoRI y XhoI del vector pcDNA-Flag o los sitios XhoI y SalI del vector pCS3+MTBX, lo que dio como resultado Flag-mPellino3 o Myc-mPellino3. El ADNc de GSK3β humana de longitud completa se amplificó mediante PCR a partir de un plásmido que codifica HA-GSK3β49 descrito previamente y luego se subclonó en los sitios EcoRI y SalI del vector pCS3+MTBX o los sitios EcoRI y NcoI del vector pCS5-Flag para producir 6xMyc- GSK3β o Flag-GSK3β. Se subclonó GSK3β de ratón de longitud completa en los sitios EcoRV y NcoI del vector pCS5-Flag, lo que dio como resultado Flag-mGSK3β. Los ADNc de JNK1, JNK2 y MLK3 de longitud completa se adquirieron de Addgene (Watertown, MA, EE. UU.) y se subclonaron en los sitios EcoRV y XhoI del vector pcDNA-Flag después de la amplificación por PCR. Los ADNc de MKK4 y MKK7 humanos de longitud completa se amplificaron a partir de los ADNc de las células HEK293 y se subclonaron en los sitios BamHI/XhoI y EcoRI/XhoI del vector pcDNA-Flag, que produjo Flag-MKK4 y Flag-MKK7, respectivamente. Se generaron mutantes catalíticamente inactivos de ADNc humanos de Pellino3a y Pellion3b y de ratón Pellino3 usando el kit de mutagénesis QuikChange (Stratagene, La Jolla, CA, EE. UU.) usando Flag-hPellino3a, Flag-hPellino3b y Flag-mPellino3 como plantillas, lo que produjo Flag-hPellino3a -CI, Flag-hPellino3b-CI y Flag-mPellino3-CI. El mutante GSK3β-S9A de ratón también se generó utilizando el kit de mutagénesis QuikChange, lo que resultó en Flag-mGSK3β-S9A. Los plásmidos que codifican la ubiquitina marcada con HA (HA-Ubi) y la ubiquitina marcada con His (His-Ubi) se describieron previamente47,48. Las porciones generadas por PCR de todas las construcciones en este estudio se verificaron mediante secuenciación. Las secuencias de los cebadores utilizados para la amplificación por PCR y la mutagénesis dirigida al sitio en este estudio se describen en la Tabla complementaria 3.

Los ensayos de inmunotransferencia e inmunoprecipitación se realizaron como se describió anteriormente49. Los nombres de las empresas, los números de catálogo, las especies y las proporciones de dilución de los anticuerpos utilizados para la inmunotransferencia y la inmunoprecipitación se describen en la Tabla complementaria 4. El aislamiento de la síntesis total de ARN y ADNc se realizó como se describió anteriormente49. Las secuencias de los cebadores para los ARNm de Peli3, Tnf e Ifn1 utilizados para la qRT‒PCR en tiempo real se describen en la Tabla complementaria 1. La qRT‒PCR en tiempo real se realizó con una máquina de PCR en tiempo real CFX Connect y iQ SYBR Green SuperMix ( Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.) para medir la expresión de genes en las siguientes condiciones: 40 ciclos de 95 °C durante 10 s, 62 °C durante 10 s y 72 °C durante 30 s. Todas las reacciones se repitieron de forma independiente al menos tres veces para garantizar la reproducibilidad.

Todos los experimentos, incluidas las inmunotransferencias, se realizaron con tres réplicas biológicas independientes. Los resultados se expresan como medias ± DE. La significación estadística se calculó mediante ANOVA de una o dos vías utilizando el software GraphPad Prism 5 (GraphPad, La Jolla, CA, EE. UU.). Se consideró que P < 0,05 indicaba significación estadística.

Detalles del análisis histológico, infiltración de neutrófilos, ensayo de etiquetado de extremo de desoxiuridina trifosfato mediado por desoxiuridina trifosfato terminal (TUNEL), aislamiento primario de hepatocitos, mediciones de glutatión y especies reactivas de oxígeno, 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)- Bromuro de 2,5-difeniltetrazolio (MTT) y ensayos de actividad lisosomal, fraccionamiento de extractos citosólicos y mitocondriales, inmunotransferencia, inmunoprecipitación, ensayo de ubiquitinación in vitro, ELISA y mieloperoxidasa (MPO) se proporcionan en la información complementaria.

Aunque se ha informado que la proteína Pellino3, con su actividad ligasa E3 intrínseca, está involucrada en la activación de MAPK, como JNK y p3843,44, se desconoce su papel fisiopatológico en la lesión hepática inducida por APAP. Para abordar la función exacta de Pellino3 en la lesión hepática inducida por APAP, generamos ratones Peli3-/- KO de cuerpo entero (Fig. 1a complementaria). La desactivación del gen Peli3 se confirmó mediante el genotipado y la RT‒PCR cuantitativa en tiempo real porque todos los anticuerpos disponibles comercialmente contra la proteína Pellino3 no pudieron detectar la expresión endógena de Pellino3 (Figuras complementarias 1b, c). A ratones Peli3-/- KO de cuerpo entero y ratones de tipo salvaje (Peli3+/+ WT) se les administró por vía oral una dosis alta de APAP (500 mg/kg), y se observaron sus tasas de supervivencia durante 4 días. En el día 4, los ratones Peli3-/- KO (n = 15) mostraron una tasa de supervivencia del 80 %, mientras que los ratones Peli3+/+ WT (n = 15) mostraron una tasa de supervivencia del 20 % (P < 0,05) (Fig. 1a). Además, los niveles de biomarcadores de daño hepático, a saber, alanina aminotransferasa sérica (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST), se redujeron significativamente en ratones Peli3-/- KO en comparación con ratones Peli3+/+ WT (Fig. 1b). De acuerdo con estos resultados, la tinción con hematoxilina y eosina (H&E) de los tejidos hepáticos indicó que la muerte de células necróticas centrolobulillares y la infiltración de células inmunes, que son inducidas por el tratamiento con APAP en ratones Peli3+/+ WT, se redujeron significativamente en ratones Peli3-/- KO ( Figura 1c). El ensayo TUNEL de ratones Peli3-/- KO apoyó la reducción de la muerte celular en el hígado (Fig. 1d, e). Además, los niveles de citocinas proinflamatorias como IL-1β, IL-6 y TNFα se redujeron significativamente con el tratamiento con APAP en los sueros de ratones Peli3-/- KO en comparación con los ratones Peli3+/+ WT (Fig. 1f- h). De acuerdo con la disminución de la expresión de estas citoquinas, la inmunohistoquímica para los marcadores de neutrófilos Ly6G y Ly6C y los ensayos de MPO mostraron una infiltración reducida de neutrófilos en los hígados de ratones Peli3-/- KO (Fig. 1i, j).

Se administraron por vía oral 500 mg/kg de APAP a ratones Peli3-/- y compañeros de camada de tipo salvaje (WT), y se controló la supervivencia global de los ratones en los tiempos indicados. n = 15 por grupo. Los datos se analizaron estadísticamente mediante la prueba de rangos logarítmicos (**P < 0,05 en comparación con el grupo de control, ratones Peli3+/+ WT). b Los niveles de ALT y AST en suero se midieron a las 24 h después de la administración oral de APAP. n = 5 por grupo. Sham indica la administración de agua destilada (DW). Los datos se analizaron estadísticamente mediante ANOVA de dos vías seguido de la prueba de comparación múltiple de Bonferroni (**P < 0,01 y ****P < 0,0001 en comparación con el grupo indicado). Las barras representan las medias ± DE. c Tinción H&E de hígados aislados de ratones Peli3-/- y WT 24 h después de la administración oral de APAP. Barras de escala, 100 μM (imágenes originales), 500 μm (inserciones ampliadas). d Ensayos TUNEL de los hígados de ratones Peli3-/- y WT 24 h después de la administración oral. Barras de escala, 100 μm (imágenes originales), 500 μm (inserciones ampliadas). e Se seleccionaron al menos cinco puntos calientes en una sección de los ensayos TUNEL y se determinó el recuento promedio. Los datos se analizaron estadísticamente mediante ANOVA de dos vías seguido de la prueba de comparación múltiple de Sidak (**P < 0,01 en comparación con el grupo indicado). Las barras representan las medias ± DE. f-h ELISA de citoquinas proinflamatorias en los sueros de ratones Peli3-/- KO y Peli3+/+ WT a las 24 h después de la administración oral de APAP. n = 3 por grupo. Los datos se analizaron estadísticamente mediante ANOVA de dos vías seguido de la prueba de comparación múltiple de Bonferroni (**P < 0,01, ***P < 0,001 y ****P < 0,0001 en comparación con el grupo indicado). i Inmunohistoquímica para los marcadores de neutrófilos Ly6G/Ly6C en secciones de tejido hepático de ratones Peli3-/- y WT 24 h después de la administración oral de APAP. Barras de escala, 100 μm. j Actividades de mieloperoxidasa en lisados ​​hepáticos obtenidos de ratones Peli3-/- y WT 24 h después de la administración oral de APAP. n = 5 por grupo. Los datos se analizaron estadísticamente mediante ANOVA de dos vías seguido de la prueba de comparación múltiple de Bonferroni (***P < 0,001 en comparación con el grupo indicado). Las barras representan las medias ± DE. En (c), (d) e (i), las imágenes que se muestran son representativas de tres experimentos independientes.

Para demostrar un papel específico del hepatocito del gen Peli3 en la lesión hepática inducida por APAP, generamos ratones con depleción aguda específica del hígado del ARNm de Peli3 mediante la inyección de dos adenovirus que expresan diferentes shRNA contra el ARNm de Peli3 (Ad-shPeli3 #3 y Ad-shPeli3 #4) a través de la vena de la cola. Como control negativo, utilizamos un adenovirus que expresa shRNA no específico (Ad-shCON). El análisis cuantitativo de RT‒PCR (qRT‒PCR) en tiempo real mostró una regulación negativa significativa del ARNm de Peli3 en hepatocitos primarios que expresan adenovirus recombinantes con cada ARNhc contra el ARNm de Peli3 en comparación con los adenovirus de control (Fig. 2a). Nice se infectaron con estos adenovirus durante 72 h y posteriormente ayunaron durante 14 h, y luego se administraron 500 mg/kg de APAP por vía oral. La tinción con H&E a las 24 h después del tratamiento con APAP indicó que el daño hepático inducido por el tratamiento con APAP, como la muerte celular necrótica centrolobulillar, disminuyó significativamente en los hígados de los ratones Peli3 KD (Ad-shPeli3 #3 y #4) (Fig. 2b). Los ensayos TUNEL también indicaron una reducción en la muerte celular en los hígados de ratones Peli3 KD (Fig. 2c). Además, los niveles séricos de ALT y AST disminuyeron significativamente en los ratones Peli3 KD en comparación con los ratones de control (Fig. 2d). Estos resultados sugieren fuertemente que la deficiencia de Peli3 en los hepatocitos disminuye la lesión hepática inducida por APAP.

a Los ratones se infectaron con adenovirus que expresaban ARNhc dirigidos al ARNm de Peli3 (Ad-shPeli3 n.° 3 y Ad-shPeli3 n.° 4) a través de la vena de la cola. Los adenovirus que expresan shRNA no específico (Ad-shCON) se usaron como control. La eliminación del ARNm de Peli3 en los hepatocitos a las 96 h después de la infección de estos virus se confirmó mediante análisis qRT‒PCR. n = 3 por grupo. Los datos se analizaron estadísticamente mediante ANOVA de dos vías seguido de la prueba de comparación múltiple de Sidak (***P < 0,001 en comparación con el grupo indicado). Las barras representan las medias ± DE. b, c Los ratones se infectaron con adenovirus recombinantes y, 72 h más tarde, los ratones se mantuvieron en ayunas durante 14 h y luego se les administró por vía oral 500 mg/kg de APAP. Se realizaron tinción H&E (b) y ensayos TUNEL (c) de hígados aislados de Peli3 knockdown (Ad-shPeli3 #3 y Ad-shPeli3 #4) y ratones de control (Ad-shCON) 24 h después de la administración oral de APAP. Barras de escala, 100 μm (imágenes originales) y 500 μm (inserciones ampliadas). Las imágenes son representativas de tres experimentos independientes. d Los niveles de ALT y AST en suero se midieron a las 24 h después de la administración oral de APAP. n = 5 por grupo. Los datos se analizaron estadísticamente mediante ANOVA de dos vías seguido de la prueba de comparación múltiple de Bonferroni (**P < 0,01, ***P < 0,001 y ****P < 0,0001 en comparación con el grupo indicado). Las barras representan las medias ± DE. b–d Sham indica la administración de agua destilada (DW).

Dado que se ha demostrado que Pellino3 es necesario para la regulación de diversas vías de señalización inflamatorias, como la señalización del receptor tipo Toll, la señalización de NOD2 y las vías de señalización de TNF39,40,41,42, a continuación examinamos la expresión de genes diana como TNFα e interferón tipo I en hepatocitos para comprender si Pellino3 media en la hepatotoxicidad de APAP a través de la regulación de los mismos genes diana. Aunque la deficiencia de Peli3 inhibe la expresión de TNFα inducida por el ligando NOD2 en macrófagos derivados de la médula ósea y aumenta la expresión de IFNβ inducida por poli(I:C)39,41, la deficiencia de Peli3 en los hepatocitos no produjo diferencias significativas en la expresión de ARNm de TNFα e IFNβ en el contexto del tratamiento con APAP (Fig. 2a, b complementaria). Por el contrario, el análisis qRT‒PCR de extractos de hígado completo indicó que los niveles de expresión tanto de TNFα como de IFNβ tras el tratamiento con APAP se redujeron en los ratones Peli3-/- KO en comparación con los ratones Peli3+/+ WT (Figura complementaria 2c, d). Esta discrepancia parece deberse a las características de los extractos de hígado completo que incluyen células inmunitarias y hepatocitos. Por lo tanto, es posible que el papel mecánico de Pellino3 en la hepatotoxicidad por APAP sea distinto de su papel en las vías de señalización inflamatorias. Sin embargo, cabe señalar que los niveles de expresión de IFNβ en el contexto del tratamiento con APAP son opuestos a un hallazgo previo con respecto a la señalización de NOD239, lo que sugiere la posibilidad de que Pellino3 contribuya a la hepatotoxicidad de APAP a través de un mecanismo que no ha sido identificado con base en el conocimiento actual. con respecto a Pellino3.

Luego investigamos si el agotamiento de Peli3 después del inicio de la sobredosis de APAP muestra efectos terapéuticos. Con este fin, primero examinamos los niveles de expresión de ARNm de Peli3 en hepatocitos primarios durante el tratamiento con APAP. El análisis qRT‒PCR en tiempo real indicó que la expresión de Peli3 en los hepatocitos se vio mínimamente afectada por el tratamiento con APAP en los puntos de tiempo temprano y tardío (Fig. 3a). Para determinar los puntos temporales en los que el adenovirus recombinante que expresa shRNA contra el mRNA de Peli3 reduce los niveles endógenos de mRNA de Peli3, se inyectaron ratones Peli3+/+ WT con adenovirus recombinantes (Ad-shPeli3 #3) a través de la vena de la cola. Después del aislamiento de los hepatocitos primarios en los puntos temporales indicados, la expresión del ARNm de Peli3 se analizó mediante qRT‒PCR. Aunque la expresión de ARNm de Peli3 endógeno no se vio afectada a las 24 h después de la inyección de virus Ad-shPeli3 #3, se detectó inicialmente una reducción significativa a las 72 h después de la inyección (Fig. 3b). En base a estos resultados, los ratones WT se infectaron con adenovirus recombinantes, se ayunaron durante 14 h y se les administró por vía oral 500 mg/kg de APAP, y posteriormente se observó su supervivencia (Fig. 3c). El agotamiento de Peli3 por adenovirus recombinantes aumentó significativamente las tasas de supervivencia tanto a las 72 h como a las 96 h después del inicio de la sobredosis de APAP en comparación con las de los ratones WT inyectados con adenovirus de control (Ad-shCON) (Fig. 3c). Estos resultados sugieren que Peli3 KD puede tener potencial terapéutico en el tratamiento de la lesión hepática inducida por APAP.

a La expresión de ARNm de Peli3 en hepatocitos primarios normales en los puntos temporales indicados después del tratamiento con APAP se confirmó mediante análisis qRT‒PCR. b La reducción de la expresión de ARNm de Peli3 en hepatocitos primarios infectados con adenovirus recombinantes que expresan ARNhc específico de Peli3 (Ad-shPeli3 #3) en los tiempos indicados se confirmó mediante análisis qRT‒PCR. a, b Los datos son representativos de tres experimentos independientes y se analizaron estadísticamente mediante ANOVA de dos vías seguido de la prueba de comparación múltiple de Sidak (***P < 0,001 en comparación con el grupo indicado). ns; insignificante. Las barras representan las medias ± DE. c Se infectaron ratones Peli3+/+ WT con adenovirus recombinantes que expresaban shRNA específicos de Peli3 (Ad-shPeli3 #3 y Ad-shPeli3 #4) o adenovirus de control que expresaban shRNA no específico (Ad-shCON) y posteriormente se mantuvieron en ayunas durante 14 h. Se administró APAP (500 mg/kg) por vía oral y se controló la supervivencia global de los ratones en los tiempos indicados. n = 14 o 15 por grupo. Los datos se analizaron estadísticamente mediante la prueba de rangos logarítmicos (**P < 0,05 en comparación con el grupo de control, Ad-shCON).

Debido a que la deficiencia de Peli3 disminuye la lesión hepática inducida por APAP, es posible que Pellino3 afecte el metabolismo de APAP. Para confirmar esta posibilidad, investigamos la expresión del gen CYPE21, que codifica el citocromo hepático P450 2E1 que metaboliza APAP. El análisis de inmunotransferencia indicó que la expresión del gen CYP2E1 en los hepatocitos Peli3-/- KO era similar a la de los hepatocitos Peli3+/+ WT, lo que indica que la deficiencia de Peli3 no afecta el metabolismo de APAP (Fig. 4a). A continuación, examinamos los niveles de GSH en los hígados de los ratones Peli3-/- KO en comparación con los ratones Peli3+/+ WT porque el agotamiento de GSH es un componente principal de la hepatotoxicidad inducida por APAP2. Con este fin, aislamos hepatocitos primarios de ratones Peli3+/+ WT y Peli3-/- KO y los tratamos posteriormente con APAP 20 mM durante 2 h. Como era de esperar, los niveles totales de GSH, que incluían glutatión oxidado (GSSG) y glutatión reducido (GSH), se redujeron en los hepatocitos primarios de los ratones Peli3+/+ WT tras el tratamiento con APAP (Fig. 4b). Sin embargo, los niveles totales de GSH en los ratones Peli3-/- KO no se redujeron tanto como los de los ratones Peli3+/+ WT (Fig. 4b). De acuerdo con estos resultados, los niveles de glutatión oxidado (GSSG) y la proporción de GSSG a GSH aumentaron en los hepatocitos primarios de los ratones Peli3+/+ WT y disminuyeron significativamente en los ratones Peli3-/- KO (Fig. 4c, d). Estos resultados indicaron que la deficiencia de Peli3 conduce a una reducción en el agotamiento de GSH en la lesión hepática inducida por APAP.

a La expresión de la proteína hepática citocromo P450 2E1 (CYP2E1) en los hepatocitos primarios de ratones Peli3-/- KO y Peli3+/+ WT se controló durante el tratamiento con APAP 20 mM durante los tiempos indicados. b–d Los niveles de glutatión total (b: GSH + GSSG) y glutatión oxidado (c: GSSG) y la proporción de GSSG a GSH (d) en los hepatocitos primarios de ratones Peli3-/- y WT se midieron a 2 h después del tratamiento con APAP 20 mM. n = 3 por grupo. e Las especies reactivas de oxígeno (ROS) en los hepatocitos primarios se midieron mediante citometría de flujo utilizando H2-DCFDA y se cuantificaron. n = 3 por grupo. f Los hepatocitos primarios de ratones Peli3-/- KO y Peli3+/+ WT se incubaron con colorante MitoSOX Red, se trataron con APAP 20 mM durante 4 h y se analizaron mediante citometría de flujo para determinar la fluorescencia de MitoSOX. n = 3 por grupo. g La expresión de superóxido dismutasa 2 (SOD2) en los hepatocitos primarios de ratones Peli3-/- KO y Peli3+/+ WT se controló durante el tratamiento con APAP 20 mM durante los tiempos indicados. h La fosforilación de la histona H2AX en hepatocitos primarios obtenidos de dos ratones independientes Peli3-/- KO y Peli3+/+ WT se controló mediante inmunotransferencia en los tiempos indicados. (i) Para la evaluación de la función mitocondrial, se realizaron ensayos MTT de hepatocitos primarios de ratones Peli3-/- KO y Peli3+/+ WT recolectados después del tratamiento con APAP durante 4 h. n = 3 por grupo. j Se realizó un ensayo de actividad lisosomal utilizando un sustrato autoapagado con hepatocitos primarios de ratones Peli3-/- KO y Peli3+/+ WT después del tratamiento con APAP durante 8 h. n = 3 por grupo. b–f, i, j Los datos se analizaron estadísticamente mediante ANOVA de dos vías seguido de la prueba de comparación múltiple de Bonferroni (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 y ****P < 0,0001 en comparación con el grupo indicado). Las barras representan las medias ± DE. Las imágenes que se muestran en (a), (g) y (h) son representativas de tres experimentos independientes.

Debido a que el agotamiento de GSH en la hepatotoxicidad por APAP está relacionado con la generación de ROS, a continuación medimos los niveles de ROS en los hepatocitos primarios de ratones Peli3+/+ WT y Peli3-/- KO tras el tratamiento con APAP 20 mM mediante análisis de citometría de flujo usando colorante H2-DCFDA . A las 4 h después del tratamiento con APAP, los niveles de ROS aumentaron en los hepatocitos de los ratones Peli3+/+ WT y disminuyeron significativamente en los de los ratones Peli3-/- KO (Fig. 4e). Además de las ROS intracelulares, la tinción con MitoSOX indicó que los niveles de ROS mitocondriales se redujeron significativamente con el tratamiento con APAP en los hepatocitos Peli3-/- KO en comparación con los hepatocitos Peli3+/+ WT (Fig. 4f). Además, la expresión de la superóxido dismutasa mitocondrial 2 (SOD2), que actúa como una proteína secuestrante para eliminar las ROS, se mantuvo en hepatocitos primarios tratados con APAP de ratones Peli3-/- KO, mientras que se observó una expresión reducida en ratones Peli3+/+ WT (Figura 4g). Dado que se sabe que el estrés oxidativo y nitrosativo en la hepatotoxicidad por APAP induce daño en el ADN y disfunción mitocondrial50, a continuación examinamos la fosforilación de la histona H2AX (pH2AX), un sello distintivo de las roturas de doble cadena (DSB), en hepatocitos obtenidos de Peli3+/+ WT y ratones Peli3-/- KO tras el tratamiento con APAP. La fosforilación de la histona H2AX disminuyó significativamente en ratones Peli3-/- KO (Fig. 4h). Para evaluar la función mitocondrial en ratones Peli3-/- KO, evaluamos la actividad deshidrogenasa mitocondrial mediante el ensayo MTT. La función mitocondrial en los hepatocitos Peli3+/+ WT, pero no en los hepatocitos Peli3-/- KO, se vio significativamente afectada después del tratamiento con APAP (Fig. 4i). A continuación, utilizando un sustrato autoextinguido, cuantificamos la actividad enzimática lisosomal in situ en los hepatocitos primarios de ratones Peli3-/- KO y Peli3+/+ WT después del tratamiento con APAP durante 8 h. La actividad enzimática lisosomal aumentó con APAP en los hepatocitos Peli3+/+, lo que refleja el daño lisosomal causado después del tratamiento con APAP, mientras que la actividad enzimática se redujo en los hepatocitos Peli3-/- (Fig. 4j). Estos resultados proporcionan evidencia sólida que muestra que la deficiencia de Peli3 contribuye a la supresión del daño mitocondrial y lisosomal al disminuir el estrés oxidativo tras el tratamiento con APAP.

A continuación, exploramos la función molecular de la proteína Pellino3 en la lesión hepática inducida por APAP. Para encontrar una pista, primero examinamos la interacción de la proteína Pellino3 con diversas quinasas involucradas en la lesión hepática inducida por APAP porque se ha demostrado que la actividad de Pellino3 conduce a la activación de JNK43. Hay dos formas de proteínas Pellino3 en humanos producidas por corte y empalme alternativo, Pellino3a y Pellino3b43, mientras que una sola forma de Pellino3 se encuentra en ratones. Las proteínas Pellino3 humana y Pellino3 de ratón utilizadas en este estudio se denominan hPellino3 y mPellino3, respectivamente.

Los ensayos de coinmunoprecipitación revelaron que la proteína Pellino3a humana, que es la forma más larga, se unía fuertemente a GSK3β y MLK3, que son MAP3K, pero se unía débilmente a JNK (Fig. 5a). De manera similar, hPellino3b, la forma más corta, también se unió a GSK3β y MLK3 (Figuras complementarias 3a, b). Estos resultados nos llevaron a investigar si la proteína Pellino3 humana con su actividad ligasa E3 induce la ubiquitinación de GSK3β y MLK3. Los plásmidos que codifican HA-GSK3β y His-Ubi se cotransfectaron en células HEK293 en presencia de Flag-hPellino3, Flag-hPellino3b de tipo salvaje o mutantes catalíticamente inactivos en los que los residuos de cisteína dentro del sitio activo de hPellino3a o hPellino3b se mutaron en alaninas, y luego se realizaron ensayos desplegables de Ni-NTA. La poliubiquitinación de GSK3β se observó con ambas proteínas Pellino3 humanas pero no con los mutantes catalíticamente inactivos de hPellino3a y hPellino3b (Fig. 5b). Además, la poliubiquitinación de la proteína GSK3β también se encontró con Flag-mPellino3 de tipo salvaje, pero no con el mutante catalíticamente inactivo de mPellino3 (Fig. 5c). A diferencia de GSK3β, hPellino3a y hPellino3b no poliubiquitinaron la proteína MLK3 (Fig. 4 complementaria). Estos resultados indicaron la posibilidad de que tanto Pellino3 humano como de ratón regulen específicamente la lesión hepática inducida por APAP a través de la poliubiquitinación de GSK3β. Aunque no excluimos la posibilidad de que Pellino3 pueda modular la hepatotoxicidad de APAP a través de la interacción con MLK3, nos enfocamos en la identificación del mecanismo molecular de la lesión hepática inducida por APAP basada en la poliubiquitinación de GSK3β mediada por Pellino3. Para confirmar aún más la interacción endógena de Pellino3 con GSK3β en hepatocitos primarios de ratón, realizamos ensayos de inmunoprecipitación. Sin embargo, no pudimos confirmar la interacción endógena entre las dos proteínas porque todos los anticuerpos disponibles comercialmente contra Pellino3 no detectaron la expresión endógena de Pellino3. A pesar de estos problemas, transfectamos el plásmido que codifica Flag-mPellino3 en hepatocitos primarios Peli3-/- KO. Después del tratamiento con APAP durante las duraciones indicadas, se realizaron ensayos de inmunoprecipitación con un anticuerpo anti-Flag. La proteína Flag-Pellino3 expresada ectópicamente en hepatocitos Peli3-/- KO interactuó específicamente con GSK3β endógeno a las 2 h después del tratamiento con APAP (Fig. 5d).

a Se cotransfectó un plásmido que codifica HA-hPellino3 en células HEK293 con los plásmidos marcados con Flag indicados. Los lisados ​​celulares se inmunoprecipitaron (IP) con anticuerpos anti-Flag y posteriormente se inmunotransfirieron (IB) con anticuerpos anti-HA y anti-Flag. Los lisados ​​de células totales (TCL) se sometieron a inmunotransferencia con los anticuerpos indicados. b Después de cotransfectar un plásmido que codifica His-Ubi de tipo salvaje con HA-GSK3β en células HEK293 en ausencia o presencia de Flag-hPellino3a, Flag-hPellino3a-CI, Flag-hPellin3b y Flag-hPellino3b-CI, Ni-NTA- Se realizaron ensayos pull-down mediados. Los TCL se inmunotransfirieron con los anticuerpos indicados. c Los plásmidos que codifican 6xMyc-GSK3β y HA-Ubi se cotransfectaron en células HEK293 junto con un plásmido que codifica Flag-mPellino3 de tipo salvaje o un mutante catalíticamente inactivo (CI) de Flag-mPellino3 (Flag-mPellino3-CI). La ubiquitinación de GSK3β se examinó mediante inmunoprecipitación utilizando un anticuerpo anti-Myc en condiciones desnaturalizantes con SDS al 1 % e inmunotransferencia con un anticuerpo anti-HA. Los TCL se inmunotransfirieron con los anticuerpos indicados. d Un plásmido que codifica Flag-mPellino3 se transfectó en hepatocitos Peli3-/- KO y posteriormente se trató con 20 mM durante los tiempos indicados. Los lisados ​​celulares se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-Flag y posteriormente se inmunotransfirieron con anticuerpo anti-GSK3β. Los TCL se inmunotransfirieron con los anticuerpos indicados. e Para la ubiquitinación de la proteína GSK3β endógena, los hepatocitos primarios de ratones Peli3-/- y WT se trataron con APAP 20 mM durante 2 h o 4 h. Los lisados ​​celulares se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-GSK3β en condiciones desnaturalizantes con SDS al 1 % y posteriormente se sometieron a inmunotransferencia con anticuerpo anti-ubiquitina (FK2-HRP). Los TCL se inmunotransfirieron con los anticuerpos indicados. Como control negativo, los lisados ​​celulares se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-IgG. f Un plásmido que codifica ubiquitina de tipo salvaje (HA-Ubi-WT) o mutantes de ubiquitina que solo median la poliubiquitinación ligada a K48 (HA-Ubi-K48) o ligada a K63 (HA-Ubi-K63) se transfectó en células HEK293 con 6xMyc -GSK3β y Flag-hPellino3a en las combinaciones indicadas. Los lisados ​​celulares se inmunoprecipitaron (IP) con anticuerpo anti-Myc y posteriormente se inmunotransfirieron (IB) con anticuerpo anti-HA. Los TCL se inmunotransfirieron con los anticuerpos indicados. g Un plásmido que codifica HA-GSK3β se cotransfectó en células HEK293 junto con una mayor expresión dependiente de la dosis de Flag-hPellino3a. Los lisados ​​celulares se sometieron a inmunotransferencia con los anticuerpos indicados. En todas las inmunotransferencias, la expresión de β-actina se utilizó como control de carga. Las imágenes de esta figura son representativas de al menos tres experimentos independientes.

A continuación, examinamos si la poliubiquitinación de GSK3β endógena está regulada por Pellino3 para verificar la importancia de la poliubiquitinación de GSK3β mediada por Pellino3 en la lesión hepática inducida por APAP. Se aislaron hepatocitos de ratones Peli3+/+ WT y Peli3-/- KO, se trataron con APAP durante los tiempos indicados y se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-GSK3β contra la proteína GSK3β endógena en condiciones desnaturalizantes con SDS al 1 % y se observó poliubiquitinación de GSK3β endógena mediante inmunotransferencia. con anticuerpo anti-ubiquitina. Se observó una mayor poliubiquitinación de GSK3β endógena en hepatocitos Peli3+/+ WT hasta 4 h después del tratamiento con APAP (Fig. 5e). Sin embargo, la poliubiquitinación de GSK3β endógena disminuyó significativamente en los hepatocitos Peli3-/- KO (Fig. 5e). Debido a que el proceso de poliubiquitinación requiere la unión de una ligasa E3 a un sustrato específico, nuestros resultados indican claramente que Pellino3 es responsable de la poliubiquitinación de GSK3β en la lesión hepática inducida por APAP a través de la unión directa a GSK3β.

Con base en estos hallazgos, a continuación investigamos el patrón de poliubiquitinación de GSK3β por Pellino3 humano. La ubiquitina de tipo salvaje (HA-Ubi), el mutante de ubiquitina K48 (HA-Ubi-K48) en el que seis residuos de lisina excepto la lisina 48 se sustituyen en arginina, y el mutante de ubiquitina K63 (HA-Ubi-K63) en el que solo la lisina 63 que se dejaron intactos se cotransfectaron en células HEK293 con 6xMyc-GSK3β en ausencia o presencia de Flag-hPellino3a. Pellino3 aumentó la poliubiquitinación de GSK3β unida a K63, pero no a K48 (Fig. 5f). Debido a que se sabe que la poliubiquitinación ligada a K63 está involucrada en diversas actividades celulares, como la transducción de señales, el tráfico de proteínas, la interacción proteína‒proteína y la reparación del ADN51,52, es posible que la poliubiquitinación de GSK3β ligada a K63 por Pellino3 influya en la transducción de señales mediada por GSK3β. en la lesión hepática inducida por APAP y no afecta la estabilidad de la proteína GSK3β. De hecho, la expresión de Pellino3 humano no afectó de manera dependiente de la dosis la estabilidad de GSK3β, y este proceso está mediado por la poliubiquitinación ligada a K48 (Fig. 5g).

Nuestros hallazgos actuales indican fuertemente que Pellino3 actúa como una ligasa E3 para inducir la poliubiquitinación de GSK3β. GSK3β es constitutivamente activo en el citoplasma, y ​​su actividad se potencia mediante la fosforilación en la tirosina 216 o se inhibe mediante la fosforilación en la serina 9 (Ser9)53,54. Curiosamente, se sabe que el tratamiento con APAP aumenta la fosforilación de las formas activa e inhibida de GSK3β y provoca la translocación de proteínas GSK3β tanto fosforiladas como totales en las mitocondrias32. Sin embargo, aún no está claro por qué la forma inhibida de GSK3β aumenta en la lesión hepática mediada por APAP y cómo GSK3β se traslada a las mitocondrias.

Por lo tanto, a continuación examinamos cómo Pellino3 modula la función de GSK3β en la lesión hepática inducida por APAP. Con este fin, investigamos la fosforilación y translocación mitocondrial de GSK3β en hepatocitos obtenidos de ratones Peli3+/+ WT y Peli3-/- KO a los que se les administró APAP por vía oral. El nivel de fosforilación en Ser9 de GSK3β disminuyó significativamente en ratones Peli3-/- KO, mientras que la fosforilación de tirosina 216 (Tyr216) apenas se vio afectada por la deficiencia de Peli3 (Fig. 6a). Los ensayos de fraccionamiento citoplasmático y mitocondrial revelaron que la translocación mitocondrial de GSK3β total y GSK3β fosforilada en Ser9 se inició 1 h después del tratamiento con APAP en hepatocitos Peli3+/+ WT. Por el contrario, la translocación mitocondrial de GSK3β y la fosforilación en Ser9 disminuyeron significativamente en los ratones Peli3-/- KO en comparación con los ratones Peli3+/+ WT (Fig. 6b). Sin embargo, la fosforilación reducida de GSK3β en Ser9 en la fracción mitocondrial de los hepatocitos Peli3-/- parece deberse a la disminución de la translocación mitocondrial de GSK3β total.

a Lisados ​​de hígado completo aislados de ratones Peli3-/- y WT en los tiempos indicados después de la administración oral de 500 mg/kg de APAP se sometieron a inmunotransferencia con los anticuerpos indicados para examinar la fosforilación de GSK3β. b Los hepatocitos primarios aislados de ratones Peli3-/- y WT se trataron con APAP 20 mM durante los tiempos indicados y posteriormente se fraccionaron en extractos citoplasmáticos y mitocondriales. Ambos extractos se inmunotransfirieron con los anticuerpos indicados contra GSK3β fosforilada en Ser9 y GSK3β total. La expresión de tubulina y COX IV se utilizó como marcadores citoplasmáticos y mitocondriales y controles de carga, respectivamente. c Los lisados ​​de hígado completo obtenidos de ratones Peli3-/- y WT 4 h después de la administración oral de 500 mg/kg de APAP se inmunotransfirieron con anticuerpos para detectar la fosforilación y el nivel total de JNK. d Los hepatocitos primarios aislados de ratones Peli3-/- y WT se trataron con APAP 20 mM durante 2 horas o 4 horas y, posteriormente, se fraccionaron en extractos citoplasmáticos y mitocondriales. Ambos extractos fueron inmunotransferidos con los anticuerpos indicados. e Para los experimentos de rescate, se transfectó Flag-Pellino3 de tipo salvaje o un mutante catalíticamente inactivo (CI) de Pellino3 en hepatocitos primarios obtenidos de ratones Peli3-/-. Como control, se transfectó un vector simulado en hepatocitos primarios obtenidos de ratones de tipo salvaje. Después de tratar ambos conjuntos de hepatocitos con APAP 20 mM durante 2 h, se fraccionaron en extractos citoplásmicos y mitocondriales y posteriormente se sometieron a inmunotransferencia con los anticuerpos indicados para detectar la fosforilación de GSK3β en el residuo Ser9 y los niveles totales de GSK3β. En (d) y (e), se utilizaron tubulina y COX IV como marcadores citoplasmáticos y mitocondriales y controles de carga. f Los plásmidos que codifican Flag-mGSK3β de tipo salvaje, el mutante Flag-mGSKβ-S9A y HA-Ubi se cotransfectaron en células HEK293 junto con un plásmido que codifica Myc-mPellino3 de acuerdo con las combinaciones indicadas. La ubiquitinación de GSK3β se examinó mediante inmunoprecipitación usando un anticuerpo anti-Flag e inmunotransferencia con un anticuerpo anti-HA-HRP. Los lisados ​​de células totales (TCL) se sometieron a inmunotransferencia con los anticuerpos indicados. g Se transfectaron hepatocitos primarios de ratones Peli3+/+ WT con Flag-mGSK3β de tipo salvaje o el mutante Flag-mGSK3β-S9A y posteriormente se trataron con APAP durante 8 h. Los extractos celulares se inmunotransfirieron con anticuerpos anti-fosfo-H2AX y anti-Flag. h Después de transfectar los plásmidos que codifican HA-Ubi-WT, HA-Ubi-K48 y HA-Ubi-K63 en hepatocitos Peli3+/+ WT y Peli3−/− KO según las combinaciones indicadas, las células se trataron con APAP 20 mM durante 2 h, y los extractos celulares se inmunotransfirieron con los anticuerpos indicados. a, c, f, g, h La expresión de β-actina se utilizó como control de carga. Todas las imágenes de inmunotransferencia de esta figura son representativas de al menos tres experimentos independientes.

A continuación, investigamos el efecto de la deficiencia de Peli3 en la activación de JNK en la lesión hepática inducida por APAP porque se ha informado que la activación de JNK está aguas abajo de GSK3β durante la hepatotoxicidad de APAP y JNK también se transloca a las mitocondrias27,34. Después de aislar los hepatocitos de ratones independientes Peli3+/+ WT (n = 5) y Peli3-/- KO (n = 3) a los que se administró APAP por vía oral, analizamos la fosforilación de JNK mediante inmunotransferencia. Tras el tratamiento con APAP, la fosforilación de JNK aumentó en tres ratones Peli3+/+ WT independientes y disminuyó profundamente en ratones Peli3-/- KO (Fig. 6c). Además, la translocación mitocondrial de JNK fosforilada y JNK total del citoplasma disminuyó significativamente con el tratamiento con APAP en ratones Peli3-/- KO en comparación con ratones Peli3+/+ WT (Fig. 6d). Similar a los resultados encontrados para GSK3β, la reducción de la fosforilación de JNK en la fracción mitocondrial de los hepatocitos Peli3-/- parece estar causada por la disminución de la translocación mitocondrial de JNK. Estos resultados implican colectivamente que Pellino3 es un componente de señalización aguas arriba que regula la fosforilación y la translocación mitocondrial de GSK3β, que posteriormente regula la fosforilación de JNK en el citoplasma y la translocación mitocondrial de JNK en la lesión hepática inducida por APAP.

A continuación, realizamos experimentos de rescate para evaluar claramente la importancia de la actividad de la ligasa E3 de Pellino3 en la fosforilación y la translocación mitocondrial de GSK3β. Los hepatocitos obtenidos de ratones Peli3-/- KO, así como hepatocitos Peli3+/+ WT, se transfectaron con mFlag-Pellino3 de tipo salvaje o un mutante catalíticamente inactivo de Pellino3 (Flag-mPellino3-CI), respectivamente, los hepatocitos se trataron con APAP para 2 h y posteriormente separados en fracciones citoplasmáticas y mitocondriales. De manera similar a nuestros resultados anteriores (Fig. 6a, b), la translocación mitocondrial de GSK3β y la fosforilación de Ser9 disminuyeron en los hepatocitos Peli3-/- KO en comparación con los hepatocitos Peli3+/+ WT (Fig. 6e; Carriles 2, 4, 10, 12). Curiosamente, la expresión ectópica de mPellino3 de tipo salvaje en los hepatocitos Peli3-/- KO restauró significativamente la translocación mitocondrial y la fosforilación de Ser9 de GSK3β (Fig. 6e; Carriles 4, 6, 12, 14), mientras que la expresión del mutante catalíticamente inactivo de Pellino3 (Flag-mPellino3-CI) no produjo este efecto (Fig. 6e; Carriles 6, 8, 14). Estos resultados sugieren que la actividad ligasa E3 de Pellino3 es crucial para la regulación de GSK3β en la lesión hepática inducida por APAP.

Aunque nuestros hallazgos actuales indican que la fosforilación de GSK3β Ser9 requiere la actividad de ligasa E3 de Pellino3 (Fig. 6a, b), es posible que la fosforilación de GSK3β en Ser9 pueda ser necesaria para la ubiquitinación de GSK3β mediada por Pellion3. Para probar esta posibilidad, examinamos la ubiquitinación del mutante GSK3β-S9A, en el que el residuo Ser9 se sustituyó con alanina. El mutante GSK3β-S9A fue poliubiquitinado por la proteína Pellino3 de tipo salvaje, similar a la GSK3β de tipo salvaje (Fig. 6f). Junto con nuestros hallazgos actuales, estos resultados indican que la ubiquitinación de GSK3β mediada por Pellino3 está aguas arriba de la fosforilación de GSK3β Ser9, que es esencial para la hepatotoxicidad de APAP, y la fosforilación de GSK3β en Ser9 no es un requisito previo para la ubiquitinación de GSK3β por Pellino3. De hecho, la importancia de la fosforilación de GSK3β en Ser9 en la hepatotoxicidad por APAP se confirmó con los resultados de que la expresión ectópica del mutante GSK3β-S9A en los hepatocitos Peli3+/+ WT no aumentó la fosforilación de la histona H2AX tras el tratamiento con APAP (Fig. 6g ).

Además, investigamos la importancia de la poliubiquitinación ligada a K63 de GSK3β por Pellino3 en la fosforilación de GSK3β en Ser9 y su translocación mitocondrial. Los plásmidos que codifican el mutante de ubiquitina K48 (HA-Ubi-K48) o K63 (HA-Ubi-K63) se transfectaron transitoriamente en hepatocitos primarios Peli3+/+ WT o Peli3-/- KO, y las células se trataron posteriormente con APAP durante 2 h . Como control, también se transfectó ubiquitina de tipo salvaje (HA-Ubi-WT) en hepatocitos primarios. La fosforilación de GSK3β en Ser9 y su translocación mitocondrial en hepatocitos Peli3+/+ WT aumentaron basalmente con el tratamiento con APAP en presencia de ubiquitina de tipo salvaje (HA-Ubi-WT) y el mutante de ubiquitina K48 (HA-Ubi-K48) ( Fig. 6h y Fig. 5 complementaria). Por el contrario, la expresión del mutante de ubiquitina K63 (HA-Ubi-K63) aumentó aún más la fosforilación de GSK3β endógena en Ser9 y su translocación mitocondrial mediante el tratamiento con APAP en comparación con los resultados obtenidos con HA-Ubi-WT y HA-Ubi-K48 ( Fig. 6h y Fig. 5 complementaria). Este aumento significativo en la fosforilación de GSK3β en Ser9 y su translocación mitocondrial en presencia de HA-Ubi-K63 no se observó en los hepatocitos primarios Peli3-/- KO (Fig. 6h y Fig. 5 complementaria). Por lo tanto, estos resultados respaldan nuestro hallazgo actual de que la poliubiquitinación de GSK3β ligada a K63 por Pellino3 es necesaria para la fosforilación de GSK3β en Ser9 y la translocación mitocondrial en la lesión hepática inducida por APAP.

Aunque la fisiopatología de la lesión hepática mediada por APAP y las vías de señalización que gobiernan esta hepatotoxicidad se han estudiado ampliamente durante las últimas décadas, no tenemos una comprensión clara de los sistemas modificadores de ubiquitina que regulan la modificación postraduccional de los componentes de señalización en el hígado inducido por APAP. lesión. Solo unos pocos estudios han sugerido que las ligasas E3 como la gp78/AMFR politópica del retículo endoplásmico (receptor del factor de motilidad autocrina), Parkin y HOIP están involucradas en la lesión hepática inducida por APAP mediante el uso de ratones knockout o tecnología de interferencia de ARN55,56,57.

En este estudio, demostramos que la proteína Pellino3 es una nueva ligasa de ubiquitina E3 en la lesión hepática inducida por APAP y que la poliubiquitinación de GSK3β ligada a K63 por Pellino3 conduce a la fosforilación de GSK3β en Ser9 en el citoplasma y la translocación mitocondrial. La GSK3β fosforilada contribuye al aumento de los niveles de ROS mitocondriales, la disfunción mitocondrial y el daño del ADN, lo que eventualmente resulta en la muerte celular necrótica (Figura 6 complementaria). Además, los hallazgos de que la expresión del ARNm de Peli3 apenas se ve afectada por el tratamiento con APAP indican que la interacción de Pellino3 con GSK3β es más importante que la regulación del ARNm de Peli3 en la hepatotoxicidad por APAP. Por lo tanto, este es el primer estudio que identifica a Pellino3 como una ubiquitina ligasa E3 dirigida a GSK3β en hepatocitos y revela su papel fisiopatológico en APAP administrado por vía oral a ratones Peli3-/- KO.

En este estudio, planteamos la hipótesis de que Pellino3 puede desempeñar un papel importante en la lesión hepática inducida por APAP porque se ha identificado que Pellino3 promueve la activación de c-Jun y Elk-1 y está involucrado en diversas vías de señalización inflamatoria al dirigirse a diferentes sustratos25,43 . En este documento, mostramos claramente una reducción de la lesión hepática inducida por APAP tanto en ratones Peli3-/- KO de cuerpo entero como en ratones con agotamiento de Peli3 específicos de hepatocitos. Este efecto protector de la deficiencia de Peli3 en la hepatotoxicidad de APAP parece deberse a disminuciones en la fosforilación y translocación mitocondrial de GSK3β acompañadas de reducciones en ROS mitocondriales y disfunción y daño en el ADN. De hecho, la creciente evidencia indica que los cambios desastrosos causados ​​por el tratamiento con APAP requieren la fosforilación de GSK3β y JNK y su translocación mitocondrial, y GSK3β está aguas arriba de JNK32,58. Nuestros hallazgos actuales con ratones Peli3-/- KO proporcionan evidencia sólida que muestra que la ubiquitinación de GSK3β mediada por Pellino3 en los hepatocitos es un paso esencial para la fosforilación de GSK3β en Ser9 y la translocación mitocondrial de GSK3β, que son fundamentales para el daño mitocondrial en la hepatotoxicidad de APAP. Sin embargo, no pudimos excluir la posibilidad de que Pellino3 en las células inflamatorias contribuya a la hepatotoxicidad por APAP de una manera no identificada porque se ha informado que Pellino3 está involucrado en diversas vías de señalización inflamatoria.

Aunque GSK3β ha recibido atención como un importante regulador de la actividad mitocondrial y se sabe que el tratamiento con APAP en ratones provoca la activación de GSK3β y la translocación mitocondrial32,58, todavía no conocemos el mecanismo exacto de la translocación mitocondrial de GSK3β en los hepatocitos. Una pista sobre cómo se transloca GSK3β en las mitocondrias puede derivarse de experimentos informados previamente en cardiomioblastos H9c259. En estas células, GSK3β se transloca a las mitocondrias bajo estrés oxidativo al interactuar con el canal de aniones dependiente de voltaje 2 (VDAC2) de una manera que depende de la fosforilación de GSK3β en Ser959. Con base en este hallazgo previo, la poliubiquitinación de GSK3β ligada a K63 por Pellino3 puede ser crucial para la interacción de GSK3β con cierto factor en la membrana mitocondrial en la lesión hepática inducida por APAP. Por lo tanto, nuestro estudio puede proporcionar pistas para una mayor expansión de nuestro conocimiento del mecanismo de la translocación mitocondrial de GSK3β tras el tratamiento con APAP.

Sin embargo, es probable que las funciones de Pellino3 en GSK3β se expandan más allá de la translocación mitocondrial de GSK3β. En comparación con los ratones Peli3+/+ WT, la fosforilación de GSK3β Ser9 en el citoplasma disminuyó significativamente en los ratones Peli3-/- KO, mientras que no se detectó un cambio en la fosforilación de la tirosina 216. En general, se sabe que la actividad de GSK3β se potencia mediante la fosforilación de tirosina 216 o se inhibe mediante la fosforilación de Ser9. Sin embargo, según los informes, el tratamiento con APAP aumenta la fosforilación de las formas activa e inhibida de GSK3β, aunque la razón no se ha abordado hasta ahora32. Debido a que no se han informado quinasas que fosforilan directamente GSK3β en Ser9, es posible que la actividad de ligasa E3 de Pellino3 regule ciertas quinasas que controlan la fosforilación de GSK3β en Ser9. En este sentido, cabe destacar que la expresión de GSK3β y la fosforilación de la glucógeno sintasa (GS), que es el sustrato de GSK3beta, se redujeron en los extractos de hígado de ratones MLK3 KO tras el tratamiento con APAP, lo que implica que MLK3 está conectado a GSK3β a través de un bucle de retroalimentación positiva en la lesión hepática inducida por APAP33. Sin embargo, no hay evidencia directa que demuestre que MLK3 es una quinasa que fosforila GSK3β en Ser9. Teniendo en cuenta nuestro hallazgo de que Pellino3 se une a MLK3 independientemente de su actividad de ligasa E3, vale la pena investigar si la poliubiquitinación de GSK3β ligada a K63 por Pellino3 promueve la fosforilación de GSK3β en Ser9 por MLK3 o una quinasa desconocida. Según un resumen de los hallazgos y los detallados en informes anteriores, la poliubiquitinación de GSK3β ligada a K63 mediada por Pellino3 está críticamente relacionada con la fosforilación de GSK3β en Ser9 en el citoplasma, y ​​su fosforilación en Ser9 promueve la translocación mitocondrial de GSK3β en la hepatotoxicidad por APAP. Esta especulación puede estar respaldada en parte por un hallazgo previo de que la translocación mitocondrial de GSK3β en los cardiomioblastos H9c2 depende de la fosforilación de Ser959.

Además, nuestros resultados de que la deficiencia de Peli3 reduce la generación de ROS y los niveles de GSH hepático indican fuertemente que Pellino3 puede estar involucrado en el estrés oxidativo inducido por APAP de una manera no identificada. Por lo tanto, es posible que Pellino3 pueda estar relacionado con la expresión de enzimas antioxidantes como la superóxido dismutasa 2 (SOD2). Por lo tanto, el mecanismo subyacente a través del cual Pellino3 regula específicamente la expresión de enzimas antioxidantes como SOD2 en la hepatotoxicidad por APAP debería ser un tema de interés futuro.

Nuestros hallazgos de que Pellino3 se une a las MAP quinasas GSK3β, MLK3 y JNK1 con diferentes fuerzas de unión implican que Pellino3 puede tener actividad de andamiaje en la vía de señalización que regula la hepatotoxicidad de APAP. Esta especulación sería coherente con el hallazgo anterior de que Pellino3 actúa como una proteína de andamiaje43. Además, nuestro estudio mostró que el aumento de la tasa de supervivencia de ratones administrados por vía oral APAP se correlaciona con la reducción de la expresión endógena de ARNm de Peli3 por adenovirus recombinantes que expresan shARN específicos de Peli3, lo que sugiere que el agotamiento de Peli3 después del inicio de la hepatotoxicidad por APAP es capaz de reducir la hepatotoxicidad hepática. daño. Este hallazgo enfatiza la importancia del eje Pellino3-GSK3β en el inicio y la progresión de la hepatotoxicidad por APAP. De hecho, nuestros hallazgos actuales muestran que la ubiquitinación de GSK3β mediada por Pellino3, que conduce a la fosforilación de GSK3β en Ser9 y la translocación mitocondrial de GSK3β, es fundamental para el proceso patológico de lesión hepática inducida por APAP, y que la deficiencia de Peli3 disminuye la mitocondrial. ROS y daño, así como daño lisosomal. En conclusión, estos hallazgos sugieren fuertemente que el eje Pellino3-GSK3β en los hepatocitos es crucial para la lesión hepática inducida por APAP, lo que enfatiza que el bloqueo de la ubiquitinación de GSK3β por Pellino3 podría ser un régimen importante para el tratamiento de la hepatotoxicidad por APAP.

Jaeschke, H. Acetaminofén: hepatotoxicidad del fármaco dependiente de la dosis e insuficiencia hepática aguda en pacientes. Excavar. Dis. 33, 464–471 (2015).

Artículo PubMed Google Académico

McGill, MR & Jaeschke, H. Metabolismo y disposición del paracetamol: avances recientes en relación con la hepatotoxicidad y el diagnóstico. Farmacia Res. 30, 2174–2187 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cohen, SD et al. Unión covalente selectiva a proteínas y toxicidad en órganos diana. Toxicol. aplicación Farmacol. 143, 1–12 (1997).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Tirmenstein, MA & Nelson, SD Unión subcelular y efectos sobre la homeostasis del calcio producidos por paracetamol y un regioisómero no hepatotóxico, 3'-hidroxiacetanilida, en hígado de ratón. J. Biol. química 264, 9814–9819 (1989).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Knight, TR, Kurtz, A., Bajt, ML, Hinson, JA y Jaeschke, H. Formación de peroxinitrito vascular y hepatocelular durante la toxicidad del paracetamol: papel del estrés oxidante mitocondrial. Toxicol. Sci 62, 212–220 (2001).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Cubierta, C. et al. Daño del ADN nuclear mediado por exonucleasa y mitocondrial inducido por peroxinitrito en la hepatotoxicidad por paracetamol. J. Pharmacol. Exp. El r. 315, 879–887 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Du, K., Farhood, A. & Jaeschke, H. Mito-Tempo, un antioxidante dirigido a las mitocondrias, protege contra la hepatotoxicidad por paracetamol. Arco. Toxicol. 91, 761–773 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Fujimoto, K. et al. Sensibilidad de la lesión hepática en ratones heterocigotos Sod2 knockout tratados con troglitazona o paracetamol. Toxicol. Patol. 37, 193–200 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Ramachandran, A., Lebofsky, M., Weinman, SA y Jaeschke, H. El impacto de la deficiencia parcial de superóxido dismutasa de manganeso (SOD2) en el estrés oxidante mitocondrial, la fragmentación del ADN y la lesión hepática durante la hepatotoxicidad por paracetamol. Toxicol. aplicación Farmacol. 251, 226–233 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Agarwal, R. et al. Hepatotoxicidad inducida por acetaminofén y nitración de proteínas en ratones knockout para óxido nítrico sintasa neuronal. J. Pharmacol. Exp. El r. 340, 134–142 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Banerjee, S. et al. El inhibidor de la óxido nítrico sintasa neuronal NANT bloquea la toxicidad del paracetamol y la nitración de proteínas en hepatocitos recién aislados. Radico libre. Biol. Medicina. 89, 750–757 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Banerjee, S. et al. La trifluoperazina inhibe la hepatotoxicidad inducida por paracetamol y la formación de nitrógeno reactivo hepático en ratones y en hepatocitos recién aislados. Toxicol. Rep. 4, 134–142 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jaeschke, H., McGill, MR y Ramachandran, A. Estrés oxidante, mitocondrias y mecanismos de muerte celular en la lesión hepática inducida por fármacos: lecciones aprendidas de la hepatotoxicidad por paracetamol. Metab de drogas Rev. 44, 88–106 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kon, K., Kim, JS, Jaeschke, H. & Lemasters, JJ Transición de la permeabilidad mitocondrial en la necrosis inducida por paracetamol y la apoptosis de hepatocitos de ratón cultivados. Hepatología 40, 1170–1179 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Académico

McGill, MR et al. El mecanismo subyacente a la hepatotoxicidad inducida por paracetamol en humanos y ratones implica daño mitocondrial y fragmentación del ADN nuclear. J. Clin. Invertir. 122, 1574–1583 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ramachandran, A. et al. La proteína quinasa 3 que interactúa con el receptor es un mediador temprano crítico de la necrosis de hepatocitos inducida por paracetamol en ratones. Hepatología 58, 2099–2108 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Li, JX et al. El inhibidor de B-Raf (V600E) dabrafenib inhibe selectivamente RIP3 y alivia la lesión hepática inducida por paracetamol. Enfermedad de muerte celular. 5, e1278 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Deutsch, M. et al. Efectos divergentes del bloqueo de RIP1 o RIP3 en modelos murinos de lesión hepática aguda. Enfermedad de muerte celular. 6, e1759 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jaeschke, H., Williams, CD, Ramachandran, A. & Bajt, ML Hepatotoxicidad y reparación del paracetamol: el papel de la inflamación estéril y la inmunidad innata. Hígado Int. 32, 8–20 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Woolbright, BL & Jaeschke, H. Papel del inflamasoma en la lesión hepática inducida por paracetamol y la insuficiencia hepática aguda. J. Hepatol. 66, 836–848 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Broz, P. & Dixit, VM Inflamasomas: mecanismo de ensamblaje, regulación y señalización. Nat. Rev. Inmunol. 16, 407–420 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Ni, HM, Bockus, A., Boggess, N., Jaeschke, H. & Ding, WX La activación de la autofagia protege contra la hepatotoxicidad inducida por paracetamol. Hepatología 55, 222–232 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Ni, HM, Williams, JA, Jaeschke, H. & Ding, WX La inducción zonada de autofagia y esferoides mitocondriales limita la necrosis inducida por paracetamol en el hígado. Redox Biol. 1, 427–432 (2013).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Baulies, A. et al. La acumulación de colesterol lisosomal sensibiliza a la hepatotoxicidad por paracetamol al alterar la mitofagia. ciencia Rep. 5, 18017 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gunawan, BK et al. La quinasa N-terminal c-Jun juega un papel importante en la hepatotoxicidad por paracetamol murino. Gastroenterología 131, 165–178 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Henderson, Carolina del Norte y col. Papel crítico de la quinasa terminal c-jun (NH2) en la insuficiencia hepática aguda inducida por paracetamol. Tripa 56, 982–990 (2007).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Hanawa, N. et al. Papel de la translocación de JNK a las mitocondrias que conduce a la inhibición de la bioenergética de las mitocondrias en la lesión hepática inducida por paracetamol. J. Biol. química 283, 13565–13577 (2008).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Saito, C., Lemasters, JJ y Jaeschke, H. c-Jun N-terminal quinasa modula el estrés oxidante y la formación de peroxinitrito independientemente de la óxido nítrico sintasa inducible en la hepatotoxicidad por paracetamol. Toxicol. aplicación Farmacol. 246, 8–17 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Win, S., Than, TA, Han, D., Petrovic, LM & Kaplowitz, N. c-Jun La lesión hepática aguda dependiente de la quinasa N-terminal (JNK) por paracetamol o factor de necrosis tumoral (TNF) requiere proteína Sab mitocondrial expresión en ratones. J. Biol. química 286, 35071–35078 (2011).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Win, S., Than, TA, Min, RW, Aghajan, M. & Kaplowitz, N. c-Jun La quinasa N-terminal media en la lesión hepática del ratón a través de una nueva vía dependiente de Sab (SH3BP5) que conduce a la inactivación de Src intramitocondrial. Hepatología 63, 1987–2003 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Ramachandran, A. & Jaeschke, H. Hepatotoxicidad por paracetamol. Semin. enfermedad del hígado 39, 221–234 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shinohara, M. et al. El silenciamiento de la glucógeno sintasa quinasa-3beta inhibe la hepatotoxicidad del paracetamol y atenúa la activación de JNK y la pérdida de glutamato cisteína ligasa y secuencia de leucemia de células mieloides 1. J. Biol. química 285, 8244–8255 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sharma, M., Gadang, V. & Jaeschke, A. Papel crítico para la quinasa 3 de linaje mixto en la hepatotoxicidad inducida por paracetamol. mol. Farmacol. 82, 1001–1007 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Nakagawa, H. et al. La eliminación de la quinasa 1 reguladora de la señal de apoptosis atenúa la lesión hepática inducida por paracetamol al inhibir la activación de la quinasa N-terminal c-Jun. Gastroenterología 135, 1311–1321 (2008).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Saberi, B. et al. La proteína quinasa C (PKC) participa en la hepatotoxicidad por paracetamol a través de vías de señalización dependientes e independientes de la quinasa c-jun-N-terminal (JNK). Hepatología 59, 1543–1554 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Dara, L. et al. La proteína quinasa 1 que interactúa con el receptor media la toxicidad del paracetamol murino independientemente del necrosoma y no a través de la necroptosis. Hepatología 62, 1847–1857 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Welchman, RL, Gordon, C. & Mayer, RJ Ubiquitina y proteínas similares a la ubiquitina como señales multifuncionales. Nat. Rev Mol. Biol celular. 6, 599–609 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Moynagh, PN Las funciones de las ligasas de ubiquitina Pellino E3 en la inmunidad. Nat. Rev. Inmunol. 14, 122–131 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Siednienko, J. et al. Pellino3 se dirige a la vía IRF7 y facilita la autorregulación de TLR3 y la expresión de interferones de tipo I inducida por virus. Nat. inmunol. 13, 1055–1062 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Tzieply, N. et al. OxLDL inhibe la expresión de IFNbeta inducida por LPS mediante la modificación de TANK dependiente de Pellino3 e IRAK1/4. Celúla. Señal. 24, 1141-1149 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Yang, S. et al. Pellino3 ubiquitina RIP2 y media la señalización inducida por Nod2 y los efectos protectores en la colitis. Nat. inmunol. 14, 927–936 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Yang, S. et al. Pellino3 se dirige a RIP1 y regula los efectos proapoptóticos de TNF-alfa. Nat. común Rev. 4, 2583 (2013).

Artículo PubMed Google Académico

Jensen, LE & Whitehead, AS Pellino3, un nuevo miembro de la familia de proteínas Pellino, promueve la activación de c-Jun y Elk-1 y puede actuar como una proteína de andamiaje. J. Immunol. 171, 1500–1506 (2003).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Butler, MP, Hanly, JA & Moynagh, PN Pellino3 es un nuevo regulador corriente arriba de p38 MAPK y activa CREB de manera dependiente de p38. J. Biol. química 280, 27759–27768 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Warming, S., Costantino, N., Court, DL, Jenkins, NA & Copeland, NG Recombinación de BAC simple y altamente eficiente mediante la selección de galK. Ácidos Nucleicos Res. 33, e36 (2005).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Lewandoski, M., Meyers, EN & Martin, GR Análisis de la función del gen Fgf8 en el desarrollo de vertebrados. Harb de primavera fría. Síntoma cuant. Biol. 62, 159–168 (1997).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Jung, SM et al. Smad6 inhibe la señalización de TGF-beta1 no canónica al reclutar la deubiquitinasa A20 para TRAF6. Nat. común 4, 2562 (2013).

Artículo PubMed Google Académico

Lee, YS et al. Inhibición de respuestas inflamatorias letales a través de la selección de complejos de señalización del receptor 4 tipo Toll asociado a la membrana con un péptido derivado de Smad6. EMBOmol. Medicina. 7, 577–592 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lee, JH et al. A20 promueve la metástasis de cánceres de mama basales agresivos a través de la multi-monoubiquitilación de Snail1. Nat. Celúla. Biol. 19, 1260–1273 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Hinson, JA, Reid, AB, McCullough, SS & James, LP Hepatotoxicidad inducida por paracetamol: papel de la activación metabólica, especies reactivas de oxígeno/nitrógeno y transición de permeabilidad mitocondrial. Metab de drogas Rev. 36, 805–822 (2004).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Komander, D. & Rape, M. El código de la ubiquitina. año Rev. Bioquímica. 81, 203–229 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Kulathu, Y. & Komander, D. Ubiquitilación atípica: el mundo inexplorado de la poliubiquitina más allá de los enlaces Lys48 y Lys63. Nat. Rev Mol. Celúla. Biol. 13, 508–523 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Wang, QM, Fiol, CJ, DePaoli-Roach, AA & Roach, PJ La glucógeno sintasa cinasa-3 beta es una cinasa de doble especificidad regulada diferencialmente por la fosforilación de tirosina y serina/treonina. J. Biol. química 269, 14566–14574 (1994).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Stambolic, V. & Woodgett, JR Inactivación de mitógenos de glucógeno sintasa quinasa-3 beta en células intactas a través de la fosforilación de serina 9. Bioquímica J. 303, 701–704 (1994). punto 3.

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kwon, D., Kim, SM, Jacob, P., Liu, Y. III y Correia, MA Inducción a través de la estabilización de proteínas funcionales de los citocromos P450 hepáticos sobre gp78/receptor del factor de motilidad autocrino (AMFR) ubiquitina E3-ligasa ablación genética en ratones : relevancia terapéutica y toxicológica. mol. Farmacol. 96, 641–654 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Williams, JA et al. La eliminación crónica y la caída aguda de parkin tienen respuestas diferenciales a la mitofagia inducida por paracetamol y al daño hepático en ratones. J. Biografía. química 290, 10934–10946 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Yamamotoya, T. et al. La formación reducida de SHARPIN y LUBAC puede contribuir a la cirrosis hepática inducida por CCl(4) o paracetamol en ratones. En t. J. Mol. ciencia 18, 326 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Yang, K. et al. Las funciones clave de GSK-3beta en la regulación de la actividad mitocondrial. Celúla. Fisiol. Bioquímica 44, 1445–1459 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Tanno, M. et al. La translocación de la glucógeno sintasa quinasa-3beta (GSK-3beta), un desencadenante de la transición de permeabilidad, depende de la actividad de la quinasa y está mediada por la interacción con el canal aniónico 2 dependiente del voltaje (VDAC2). J. Biol. química 289, 29285–29296 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Descargar referencias

Este trabajo fue apoyado por la subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (SRC 2017R1A5A1014560) financiada por el Ministerio de Ciencia y TIC y en parte por una subvención (2020R1A2C3009643 a SHP) de la Fundación Nacional de Investigación de Corea.

Jun Hyeong Kim

Dirección actual: KoBio Labs, Seongnam, 13488, República de Corea

Estos autores contribuyeron por igual: Jaewon Lee, Jihoon Ha, Jun-Hyeong Kim.

Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad Sungkyunkwan, Suwon, 16419, República de Corea

Jaewon Lee, Jihoon Ha, Jun-Hyeong Kim, Dongyeob Seo, Minbeom Kim, Yerin Lee, Seong Shil Park, Jin Seok Park, Su Myung Jung, Yong-Soo Bae y Seok Hee Park

Departamento de Ciencias de la Vida, Universidad de Corea, Seúl, 02841, República de Corea

Dahee Choi y Seung-Hoi Koo

Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina de la Universidad de Gachon, Incheon, 21999, República de Corea

Joven Jae Lee y Suntaek Hong

Departamento de Farmacología, Facultad de Medicina de la Universidad de Ajou, Suwon, 16499, República de Corea

siyoung yang

SRC Center for Immune Research on Non-lymphoid Organs, Sungkyunkwan University, Suwon, 16419, República de Corea

Siyoung Yang, Yong-Soo Bae y Seok Hee Park

Medpacto Inc., Seúl, 06668, República de Corea

Kyung-Min Yang y Seong-Jin Kim

Instituto GILO, Fundación GILO, Seúl, 06668, República de Corea

Seong Jin Kim

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

JL, JH y JHK diseñaron la investigación, llevaron a cabo el trabajo experimental, analizaron los datos y escribieron el manuscrito. DS, MK, YL, SSP y JSP llevaron a cabo el trabajo experimental y analizaron los datos. DC generó los adenovirus recombinantes. YJL y SH generaron los ratones knockout y participaron en el diseño del estudio. SY, KMY, SMJ, SHK y YSB participaron en el diseño del estudio, analizaron datos y coordinaron el estudio. SJK y SHP diseñaron y conceptualizaron la investigación, supervisaron el trabajo experimental, analizaron datos y escribieron el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Seong-Jin Kim o Seok Hee Park.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Lee, J., Ha, J., Kim, JH. et al. La ablación con Peli3 mejora la lesión hepática inducida por paracetamol mediante la inhibición de la fosforilación de GSK3β y la translocación mitocondrial. Exp Mol Med (2023). https://doi.org/10.1038/s12276-023-01009-w

Descargar cita

Recibido: 15 Agosto 2022

Revisado: 07 febrero 2023

Aceptado: 15 de marzo de 2023

Publicado: 01 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s12276-023-01009-w

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt