Incrustación coplanar de múltiples modelos de células 3D en hidrogel hacia alta - Consumibles Co., Ltd de la histología de Nantong

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 9991 (2022) Citar este artículo

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Se han desarrollado métodos estandarizados y de alto rendimiento para la producción y el manejo experimental de algunos modelos 3D in vitro. Sin embargo, todavía faltan herramientas analíticas adaptadas para que los científicos e investigadores aprovechen al máximo el potencial de los modelos celulares complejos en las pruebas preclínicas de medicamentos y la medicina de precisión. La histología es el método establecido, rentable y estándar de oro para el análisis estructural y funcional de tejidos. Sin embargo, los procesos histológicos estándar son desafiantes y costosos de aplicar a modelos de células 3D, ya que su pequeño tamaño a menudo conduce a una mala alineación de las muestras, lo que reduce el rendimiento del análisis. Este cuerpo de trabajo propone un nuevo enfoque: HistoBrick facilita el procesamiento histológico de esferoides y organoides al permitir la incrustación en gel de modelos de células 3D con alineación coplanar precisa, paralela al plano de corte, minimizando así la pérdida de material de muestra. Las funciones de HistoBrick son compatibles con los estándares de automatización, lo que podría permitir la transferencia automatizada de muestras desde una placa de múltiples pocillos al dispositivo de gel. Además, la tecnología de HistoBrick se validó demostrando la alineación de esferoides cultivados con HepG2 que miden entre 150 y 200 µm de diámetro con una precisión de altura de ± 80 µm. HistoBrick permite estudiar hasta 96 muestras en secciones mínimas, allanando el camino hacia la microhistología de alto rendimiento.

Los modelos celulares tridimensionales (3D) in vitro han ido ganando terreno, ya que permiten mejores funciones, arquitectura e interfaces de tejido fisiológicamente relevantes en comparación con los cultivos bidimensionales (2D). Los modelos in vitro complejos derivados de pacientes reflejan la composición genética única. Además, los análisis ómicos y de detección de fármacos se facilitan mucho en comparación con los experimentos en animales1. En este contexto, los modelos in vitro complejos, como esferoides, organoides o tumoroides (denominados colectivamente microtejidos), se utilizan ampliamente para el modelado de enfermedades, el desarrollo preclínico de fármacos y la ingeniería de tejidos2. Los microtejidos apoyan así la implementación de la medicina personalizada3. Los modelos complejos de células en 3D4 se utilizaron principalmente para dilucidar los aspectos de la biología celular5, seguido del desarrollo de herramientas y metodologías estandarizadas para la producción, clasificación, colocación, maduración y análisis. Como tal, el análisis de alto rendimiento y el control de calidad de sistemas celulares complejos siguen siendo un desafío constante. La histología es el método estándar de oro para el análisis de la microanatomía de los tejidos; por lo tanto, el análisis histológico de los modelos celulares en 3D es una consecuencia lógica. En combinación con la inmunohistoquímica, proporciona información sobre la morfología y composición de los tejidos con la visualización de proteínas o antígenos específicos. La microhistología es una técnica poderosa para el control de calidad durante todos los pasos del procedimiento de desarrollo de tecnología de microtejidos con una necesidad creciente de análisis de punto final (Fig. 1).

Cadena de procesamiento de microtejidos que muestra la creciente necesidad de microhistología. Además del análisis de punto final y al brindar acceso a la microanatomía y la biología de los microtejidos, la microhistología ayuda a determinar el efecto de los pasos de procesamiento en las muestras (p. ej., estrés o daños que afectan la morfología y las funciones biológicas, cuando se combinan con inmunohistoquímica). Por lo tanto, es el método elegido para el control de calidad para la implementación de nuevos métodos al servicio del flujo completo del proceso de microtejido, desde la producción hasta el desarrollo del modelo de tejido. Creado con BioRender.com.

Sin embargo, los procesos histológicos actuales no están adaptados para manejar microtejidos porque son más pequeños que las muestras de biopsia y casi transparentes. Además de esto, los problemas de manejo técnico también pueden conducir a un procesamiento lento y engorroso, produciendo resultados con un rendimiento limitado que no se puede reproducir mediante la automatización6.

Inicialmente, el procesamiento histológico requiere que los microtejidos se incrusten en un hidrogel, por ejemplo, agarosa, para facilitar su manipulación para su posterior inclusión en parafina7,8. Al realizar la incrustación aleatoria, se necesitan docenas de réplicas de microtejidos para garantizar que haya suficiente material adecuado disponible para el análisis histológico relevante. Este número de repeticiones parece innecesariamente grande, y gran parte del material podría desperdiciarse considerando que podría ser más eficiente analizar menos secciones de muestra, especialmente porque la alineación precisa de 5 a 10 microtejidos en el mismo plano focal podría proporcionar suficiente información para un análisis robusto. Existe la posibilidad de alinear múltiples muestras de manera más eficiente en un plano, por ejemplo, mediante la centrifugación de microtejidos en agarosa al 0,5 % en un criotubo, al que se aludió en un estudio reciente9. Sin embargo, el enfoque de agrupación utilizado en este estudio sigue siendo costoso y aún desperdicia material biológico valioso.

Alternativamente, la transferencia y el posicionamiento manual de los microtejidos consume demasiado tiempo y provoca cuellos de botella durante la automatización. En cambio, una alternativa elegante a la inclusión manual y aleatoria de agarosa se basa en la inclusión de hidrogel paralelizado mediante micromatrices de tejido (TMA)7,8. TMA funciona bien para colocar muestras en arreglos 2D y permite la implementación de métodos de formato estándar utilizados en cultivo celular, por ejemplo, placas de pocillos múltiples. Con TMA, también se puede garantizar la trazabilidad de cada condición experimental y, en consecuencia, se puede aplicar a modelos de células 3D10,11 y a la histología de modelos de organismos pequeños, como las larvas de pez cebra12. Sin embargo, el posicionamiento vertical aleatorio de las muestras dentro de un bloque de gel obtenido hace que sea poco probable que todos los microtejidos se ubiquen dentro de la misma sección. A pesar de reducir el número de microtejidos por condición experimental en comparación con la agrupación, TMA todavía requiere que se procesen muchas secciones (p. ej., teñidas y con imágenes) para obtener todos los datos relevantes sobre las muestras, lo que resulta en altos costos de materiales y mucho tiempo para obtenerlos. -resultados.

Varios otros estudios han investigado diferentes enfoques con el objetivo de lograr una alta paralelización de la incrustación de microtejidos con fines histológicos (que consisten en cortes, tinciones e imágenes). Un método consistió en investigar hasta 96 esferoides en paralelo, utilizando un bloque de agarosa diseñado con una matriz de pozos cilíndricos llenados manualmente para analizar el impacto de la desalineación dentro del plano de corte8. Otro estudio utilizó la centrifugación a través de un colector de embudo para cargar microtejidos en un bloque de agarosa con una serie de pocillos cilíndricos13. Sin embargo, requirió la manipulación manual de la placa para preparar la transferencia. Otras publicaciones14,15,16 han propuesto la formación y cultivo de los modelos celulares 3D y su inclusión en el mismo dispositivo. Sin embargo, dicho material de laboratorio es muy específico e incompatible con las plataformas de producción de microtejidos estándar existentes. Según el conocimiento de estos autores, no se investigó la coplanaridad de las muestras dentro del bloque de gel. Además, el procesamiento histológico puede afectar la geometría del bloque de agarosa y la posición relativa de las muestras incrustadas.

Este artículo propone un método rentable y eficiente para el procesamiento histológico de microtejidos de alto rendimiento. Se describe un método robusto y fácil de usar para la preparación de múltiples muestras en un formato de matriz estándar utilizando un sustrato basado en agarosa: HistoBrick (Fig. 2). HistoBrick se diseñó para facilitar el posicionamiento de muestras, la inclusión en gel, la deshidratación, la inclusión en parafina, el corte y la obtención de imágenes ópticas, al mismo tiempo que reduce el número de secciones requeridas que necesitan análisis al alinear las muestras en un plano singular. Se puede evaluar la alineación relativa de las muestras dentro de HistoBrick y la posición del bloque en un micrótomo. Además, el enfoque de HistoBrick es compatible con el formato de procesos de automatización estándar y allana el camino hacia la estandarización y la automatización de alto rendimiento de la microhistología.

Esquema que muestra la canalización del análisis histológico en microtejidos. HistoBrick proporciona la alineación coplanar y la disposición de matrices necesarias para unir la producción de modelos de células 3D y el procesamiento histológico hacia el análisis de alto rendimiento de secciones fijadas en formalina e incluidas en parafina. Creado con BioRender.com.

Se diseñaron dos moldes de silicona que contenían 96 pilares verticales utilizando SolidWorks (Dassault Systèmes), basados en la configuración del paso de matriz de placas comerciales de 1536 pocillos. Los pilares miden 1,5 mm de diámetro y 15 mm de altura. Como se muestra en la Fig. 3, los pilares se colocaron deliberadamente en el medio del molde, dejando dos espacios abiertos disponibles a cada lado, que una vez llenos ayudan a facilitar el manejo del hidrogel durante el moldeado y desmoldado. La distancia entre los pilares y el fondo del molde es de 2 mm de altura, dejando suficiente espacio para inyectar el hidrogel necesario para obtener un HistoBrick. Los diseños de moldes se imprimieron en 3D con silicona A 50 en Spectroplast AG, Suiza.

Diseño Histobrick y bloque de hidrogel. (a) CAD del molde para la preparación de un HistoBrick de 96 pocillos, (b) Molde de silicona fabricado mediante impresión 3D, (c) HistoBrick basado en hidrogel que contiene 96 pocillos.

Los pasos principales involucrados en la preparación de HistoBrick se muestran en la Fig. 4a–d. Se añadió agarosa (Sigma-Aldrich, A7174) a HistoGel precalentado (Epredia, HG-4000-012) en una proporción de 1,5 a 2 % p/v, y la solución se agitó en un baño de agua a 80 °C hasta que la agarosa completamente disuelto. El molde de silicona se colocó con los pilares hacia abajo sobre una placa petri; habiendo sido precalentado el conjunto en un horno a 80°C. Luego se vertieron suavemente 10 ml de la mezcla de agarosa-HistoGel en el molde de silicona calentado. A continuación, estos elementos se dejaron enfriar a temperatura ambiente durante 10 min. Posteriormente, el bloque se dejó gelificar a 4 °C durante 2 h para obtener la estabilidad mecánica suficiente para el desmoldeo. El HistoBrick solidificado se desmoldó sobre una placa de Petri aplicando una suave presión manual en la zona central mientras se sujetaba por ambos lados. El HistoBrick obtenido se almacenó a 4 °C en agua desionizada y se usó en 14 días. Para permitir una mejor visualización de los pozos antes y después del procesamiento histológico, se prepararon muestras adicionales de HistoBrick agregando colorante azul (Davidson Tissue Dye) a la mezcla de agarosa-HistoGel.

Preparación y uso de HistoBrick. (a) Coloque el molde de silicona en una placa de Petri de vidrio con los pilares hacia abajo y llene el molde con la mezcla de agarosa-HistoGel por las aberturas laterales, (b) El molde lleno debe enfriarse a 4–5 °C durante 2 h, (c) Desmolde el HistoBrick presionando los lados, (d) HistoBrick sin moldear, (e) Cargue microtejidos fijos, (f) Agregue HistoGel en los pocillos y enfríe a 4–5 °C, (g) Corte el bloque utilizando la herramienta de corte, (h) Después de dividir el HistoBrick en tres segmentos, los dos segmentos laterales se pueden descartar y el segmento central que contiene los pocillos debe reservarse para el procesamiento histológico, (i) Coloque el segmento central de HistoBrick en un histólogo casete.

En este trabajo, las investigaciones se realizaron con muestras de esferoides de carcinoma hepatocelular humano (HepG2) (HB-8065, ATCC) (diámetro promedio de 150 a 200 µm) generados con Sphericalplate 5D (SP5D, Kugelmeiers Ltd.). Puede encontrar un protocolo detallado para su preparación en Métodos complementarios S1. Los microtejidos HepG2 fijados se transfirieron manualmente desde un tubo Eppendorf al HistoBrick, pipeteando un microtejido en cada pocillo con una pipeta monocanal o multicanal (Fig. 4e). Las puntas de pipeta (20 µl) se recubrieron previamente con albúmina de suero bovino (BSA) al 1% (A3059, Sigma-Aldrich) para evitar la adhesión de los microtejidos. Cada microtejido se aspiró junto con aproximadamente 5 µl de su tampón acuoso. La punta cargada se colocó cerca del fondo del pozo HistoBrick sin tocar el gel, y la muestra se dispensó lentamente para evitar que quedaran atrapadas burbujas de aire. Se permitió que los microtejidos se asentaran y sedimentaran en el pocillo durante 5 min. Después de transferir los microtejidos, se dejó que el molde absorbiera el medio acuoso extra durante aproximadamente 1 hora. Con una punta nueva, se agregaron a cada pozo 10–20 µl de HistoGel precalentado a 80 °C (Fig. 4f). Por último, el HistoBrick se dejó enfriar durante 1 h a 4 °C para que pudiera ocurrir el proceso de gelificación. Luego se almacenó a 4 °C en agua desionizada y se usó dentro de los 3 días.

Se desarrollaron y probaron varios métodos para investigar la transferencia de microtejidos HepG2 desde una placa de pocillos inicial a un HistoBrick, utilizando un sistema de manipulación de líquidos Microlab STAR (Hamilton) equipado con ocho cabezales de pipeteo y Venus Software versión 2.1. Se colocaron microtejidos HepG2 fijos (uno por pocillo) en una placa de pocillos múltiples Corning Costar Ultra-Low Attachment (ULA) de 96 pocillos (CLS7007, Merck) con 1 microtejido en 200 µl de solución salina tamponada con fosfato (PBS Gibco 2062235 ) en cada pocillo. El material de laboratorio gemelo digital se creó para soportar el HistoBrick, que se colocó en la plataforma con un soporte específico. Los métodos de transferencia incluyeron el recubrimiento previo de las puntas con BSA.

Los HistoBricks cargados con microtejidos HepG2 fijos como se describió anteriormente se recortaron para encajarlos en un casete de histología (Fig. 4g-i). Se diseñó una herramienta de corte personalizada para este propósito, como se describe en Métodos complementarios S2. El proceso histológico constaba de un paso de deshidratación seguido de limpieza e inclusión en parafina, que se realizaron siguiendo procedimientos estándar de laboratorio. El bloque incluido en parafina se colocó en un micrótomo Leica RM2265 para el corte. En total, se obtuvieron 75 secciones de un HistoBrick. El espesor de cada corte fue de 4 µm. Cada uno de los tres cortes se tiñó con hematoxilina y eosina (H&E) siguiendo protocolos estándar después de montarlos en un portaobjetos de vidrio.

Las imágenes de las secciones teñidas se adquirieron con un escáner de diapositivas completas Olympus VS120. Inicialmente, se adquirió una imagen general de todo el portaobjetos de vidrio con un aumento de 4 × para identificar las áreas que contenían microtejidos. Posteriormente, se seleccionaron y enfocaron varios microtejidos distribuidos por toda la muestra para ayudar a corregir la inclinación del portaobjetos de vidrio durante el proceso de escaneo. Finalmente, se adquirió una imagen de mayor aumento (10 × o 20 ×) de toda la sección mediante escaneo.

Las muestras de HistoBrick teñidas de azul se prepararon para una mejor visualización y sus pocillos se llenaron con HistoGel sin teñir para evaluar su diámetro en varias etapas (sobre todo en el HistoBrick recién preparado y en portaobjetos obtenidos después del procesamiento histológico). A continuación, se tomó una imagen de campo claro de las muestras con un microscopio invertido (Carl Zeiss Microscopy GmbH) y se midieron los diámetros de los pocillos en función de un ajuste circular manual utilizando la plataforma de código abierto FIJI17.

Las imágenes se procesaron en la plataforma FIJI17 y se utilizó el módulo TrackEM18 para alinear los arreglos de pozos de las distintas secciones. Las imágenes se sometieron a dos procesos, en primer lugar se seleccionaron puntos de referencia manualmente en cada imagen para garantizar la fiabilidad del rendimiento de la alineación. En segundo lugar, se aplicó una transformación rígida automatizada de imágenes a la pila completa para ajustar la alineación. Posteriormente, la ubicación del plano del ecuador de cada microtejido se identificó visualmente como el plano que contiene la sección más grande del microtejido correspondiente sobre la pila de imágenes completa. Cuando se identificaron dos secciones consecutivas de un microtejido como notablemente similares, se eligió su plano ecuatorial como el que estaba centrado entre las dos secciones. Cuando se incrustaron varios microtejidos en el mismo pozo, dado que las ubicaciones de su plano ecuatorial estaban muy cerca (diferencia < 15 µm), se promediaron juntos. Este procedimiento equilibró la contribución de cada pocillo al realizar el ajuste en las ubicaciones espaciales 3D y aseguró que el mejor plano de ajuste no estuviera sesgado por los pocillos que contenían microtejidos adicionales. Luego, las ubicaciones 3D se procesaron en MATLAB (2012, MathWorks) para identificar el mejor plano de ajuste a través de la minimización del error cuadrático medio para cada una de las muestras procesadas de HistoBrick.

Los bloques HistoBrick compuestos de agarosa se pueden producir fácilmente utilizando el molde de silicona dedicado. Los 96 pocillos del HistoBrick miden 1,7 ± 0,1 mm de diámetro después de la estabilización en agua desionizada, lo que da como resultado una desviación del 6 % del diámetro del pilar del molde. Sin embargo, se conserva el paso de una matriz estándar de 1536, lo que facilitaría la carga de muestras mediante un manipulador de líquidos automatizado.

HistoBrick es adecuado para los pasos de procesamiento histológico, incluida la deshidratación, la inclusión en parafina, el corte con un micrótomo y la tinción. La comparación de la Fig. 5c y d muestra la importancia de tener un tinte azul para facilitar la visualización de los pocillos. Para determinar el efecto del procesamiento en el bloque de hidrogel compuesto, se midieron los diámetros de los pocillos (D) y el paso de la matriz en dos ejes (P1 y P2) en los cortes de dos muestras de HistoBrick de color azul con microtejidos HepG2 incrustados (Fig. 5c–f). Los resultados muestran una contracción del 34% del diámetro del pozo. El paso medido después del procesamiento histológico fue de 1,7 mm, lo que corresponde a una reducción del 28 %. No se observaron burbujas de aire después de la incrustación en gel o dentro de las secciones histológicas (Fig. 5a). Los microtejidos HepG2 permanecieron intactos después de la tinción con H&E (Fig. 5b).

Imágenes de microtejidos HepG2 en un HistoBrick sometidos a diferentes pasos de procesamiento. (a) Un microtejido HepG2 (señalado por la flecha) después de haber sido incrustado en el HistoBrick y cubierto con HistoGel. Tenga en cuenta que no quedan burbujas de aire atrapadas dentro del micropocillo, (b) tinción con H&E de una sección de un solo microtejido, (c) Imagen de microscopía de una rebanada sin tinte. Los contornos de los pozos son difíciles de determinar. ( d ) Imagen de microscopía de una rebanada usando una mancha de color azul. Tenga en cuenta que los contornos de los pozos son claramente visibles. (e) Medir el diámetro y el paso de los pocillos en el HistoBrick antes de la inclusión en parafina, (f) Medir el diámetro y el paso de los pocillos en el HistoBrick después del corte. El parámetro D es el diámetro, mientras que P1 y P2 se utilizan para comparar el paso en los dos ejes de la matriz de micropocillos.

Dado que el rendimiento del análisis histológico depende en gran medida de cómo se colocan los microtejidos dentro del bloque durante el paso del procedimiento de corte, los autores de este artículo caracterizaron la alineación de los microtejidos HepG2 mediante el enfoque especializado HistoBrick. Para este enfoque, las muestras de microtejidos se asientan y sedimentan en el fondo de los pozos, lo que da como resultado una alineación en un plano horizontal. La Figura 6a muestra tres ejemplos de imágenes de campo claro tomadas de las secciones obtenidas para una muestra HistoBrick de 96 pocillos después de la tinción con H&E. Los microtejidos HepG2 se identifican fácilmente como puntos oscuros dentro de los límites de los pozos. Como resultado de la carga manual imprecisa de HistoBrick a partir de una suspensión de muestra, los pocillos a veces están vacíos o contienen hasta tres microtejidos. La Figura 6b ilustra el posicionamiento de los microtejidos dentro de un HistoBrick a lo largo del eje Z, en relación con la primera sección de histología y el mejor plano de ajuste. La Figura 6c muestra la posición de varios microtejidos de la primera sección de histología en cinco bloques HistoBrick (en azul) y otros 2 bloques preparados con la herramienta de posicionamiento (en verde). Suponiendo que el proceso histológico dio como resultado superficies paralelas de la parafina y la muestra HistoBrick original, el plano de alineación forma un ángulo de 0,22 ± 0,06° con el plano de corte. Este ángulo podría tener un impacto significativo en el análisis, ya que representa una desalineación relativa de aproximadamente 70 µm entre dos microtejidos en el primer y el duodécimo pocillo a lo largo de una línea de la matriz HistoBrick. Dado que el ángulo de inclinación es diferente para cada muestra de HistoBrick, se introdujo el mejor plano de ajuste para permitir la comparación directa de los microtejidos en las siete muestras (Fig. 6d). Para todas las muestras de HistoBrick, independientemente del uso de la herramienta de alineación, el 75% de los microtejidos tienen su centro ubicado en promedio ± 40 µm desde el mejor plano de ajuste. En otras palabras, el 75% de los microtejidos tienen sus centros ubicados en una banda de 80 µm de espesor en el bloque.

Coplanaridad de microtejidos HepG2 incrustados. (a) Imágenes de campo claro de tres portaobjetos teñidos con H&E del mismo bloque procesado. Los discos claros corresponden a pozos y los puntos oscuros corresponden a microtejidos, como en el ejemplo encerrado en un círculo con línea punteada, (b) Esquema de la posición de los esferoides en el HistoBrick. El plano de mejor ajuste (línea amarilla) es un plano imaginario para compensar el ángulo de inclinación (en rojo, el ángulo formado por el plano de mejor ajuste con el plano de la cuchilla del micrótomo) que es el resultado del posicionamiento manual del bloque en el micrótomo, (c) Distancia del centro de los microtejidos desde la primera sección de histología para siete muestras diferentes de HistoBrick [5 Histobricks se cortaron sin herramienta de alineación (cuadros azules) y dos HistoBricks se cortaron con herramienta de alineación (cuadros verdes)]. (d) Distancia absoluta del centro de los microtejidos desde el mejor plano de ajuste para las mismas siete muestras de HistoBrick.

Para evaluar la integración de HistoBrick en un flujo de trabajo automatizado, se probaron diferentes métodos utilizando un manipulador de líquidos automatizado y una placa ULA de 96 pocillos. Cada pocillo contenía un microtejido HepG2 con 200 µl de PBS. En teoría, cada pocillo del HistoBrick permite la recogida de un volumen de 2 a 10 µl. El enfoque desarrollado consistió en tres pasos principales, como se ilustra en la Fig. 7. En primer lugar, la extracción de un microtejido HepG2 de la placa ULA tuvo éxito solo cuando se logró la aspiración completa del volumen del pocillo (200 µl) utilizando puntas de carbono de 300 µl. aplicado. Cualquier aspiración de volumen parcial probada no atrapó con éxito los microtejidos. En segundo lugar, se implementó una pausa para que el microtejido sedimentara en el fondo de la punta. Por último, se investigó la dispensación en dos fases. En la primera fase de prueba, el contenido de la punta se dosificó por completo en una placa estándar de 96 pocillos. Con este enfoque, el 87,5 % de los esferoides HepG2 se recogieron, transfirieron y dispensaron con éxito. Este desempeño dependía del recubrimiento de la punta dosificadora (con BSA), del tamaño del esferoide y de la adherencia del microtejido al fondo de la placa. En la segunda fase de prueba, se probó la dosificación de volumen parcial para alcanzar el rango de volumen de un pocillo de HistoBrick (2–10 µl). Sin embargo, la dispensación por chorro parcial de los microtejidos dentro de un volumen inferior a 20 µl de los 200 µl recogidos no se pudo lograr de forma reproducible. Las limitaciones técnicas del hardware, así como la optimización de métodos complejos, parecían ser factores limitantes, y la transferencia automatizada uno a uno de microtejidos HepG2 de 150–200 µm no fue posible utilizando esta plataforma robótica.

Desarrollo de métodos para la transferencia de microtejidos HepG2 de 150–200 µm utilizando un manipulador de líquidos automatizado de laboratorio. Creado con BioRender.com.

La aplicación de modelos celulares 3D en los campos de la investigación y la medicina personalizada crece gradualmente, ya que permiten investigaciones detalladas sobre los mecanismos de la enfermedad, los enfoques terapéuticos in vitro y la planificación de terapias. El uso de células derivadas de pacientes es una ventaja importante, pero la fuente de células es limitada. En este contexto, la investigación basada en microtejidos debe ser fiable a lo largo de toda la cadena de procesamiento. Esto incluye, entre otros, la producción de microtejidos, la maduración, las pruebas y el análisis de punto final. En este contexto, existe una necesidad de estandarización (que a menudo requiere automatización) de los métodos analíticos que respaldan el desarrollo y la validación de procesos experimentales.

Este cuerpo de trabajo se propuso facilitar el análisis histológico de microtejidos mediante la implementación de un enfoque TMA centrado en la rentabilidad, la trazabilidad y el cumplimiento de los procedimientos de laboratorio de alto rendimiento. Estudios anteriores han demostrado la ventaja de utilizar un enfoque TMA, pero estas revisiones se realizaron en especímenes más grandes (en el rango de 500 µm de diámetro)7,8,10,11. El enfoque novedoso presentado en este documento, HistoBrick, no solo utiliza microtejidos HepG2 pequeños (150–200 µm de diámetro), sino que también permite la alineación precisa de las muestras y es compatible con diferentes hardware estándar.

HistoBrick facilitaría la microhistología de alto rendimiento al implementar material de laboratorio de hidrogel fácil de usar para la incorporación coplanar de modelos de células 3D, cuyo diseño se ha hecho compatible con los estándares de automatización. Los datos recopilados en HistoBrick demuestran que es posible realizar y recopilar resultados histológicos de hasta 96 muestras utilizando una selección más pequeña de 13 cortes. El molde de silicona diseñado facilita la replicación de los pozos de mesoescala en el hidrogel basado en agarosa, lo que da como resultado un dispositivo de múltiples pozos que se puede almacenar en condiciones húmedas durante al menos 14 días antes de cargar la muestra. La flexibilidad del molde y su diseño con las dos aberturas en ambos lados de la matriz permite que se doble lo suficiente durante el desmoldeo y ayuda a prevenir la rotura del gel. Además, el método de HistoBrick se basa exclusivamente en el asentamiento y la sedimentación pasivos de las muestras cuando se cargan en los pocillos y no se requieren pasos de manipulación adicionales después de transferir el microtejido. En términos de rendimiento, HistoBrick muestra una compatibilidad satisfactoria con todo el proceso histológico. Aunque las dimensiones de los pocillos, las matrices y las muestras se ven afectadas por los procedimientos de deshidratación e inclusión en parafina, es posible rastrear claramente las muestras ya que se conserva su disposición 2D. Además, se alinean en un plano con un rango de precisión de ~ 80 µm después del procesamiento histológico. Esto es particularmente relevante ya que los resultados se obtuvieron con microtejidos HepG2 pequeños (150–200 µm de diámetro) por lo que la precisión de alineación obtenida es cercana a la dispersión del tamaño de la muestra. Las plataformas de producción de microtejidos estandarizados más recientes garantizan un tamaño uniforme entre una matriz19,20,21. Dado que el método de alineación se basa en la sedimentación, HistoBrick está abordando en particular las necesidades analíticas de dichas plataformas.

Un estudio anterior demostró la importancia del posicionamiento de los bloques de agarosa en un micrótomo al evaluar el rendimiento de la alineación8. En este estudio, un TMA a base de agarosa se puso en contacto con un casete de histología junto con agarosa, proporcionando soporte para el corte del bloque de gel, mientras que las muestras de microtejido se ubicaron en la parte superior de los pilares frente a la cuchilla. Los bloques de HistoBrick se deshidrataron inicialmente y se incluyeron en parafina sin ningún tipo de soporte y el plano de alineación de la muestra obtenido presentaba solo un ángulo de 0,2°–0,3° con la cuchilla del micrótomo. Se diseñó una herramienta personalizada para un paso complementario de inclusión en parafina para ayudar a alinear el bloque con la cuchilla, lo que sería útil en el futuro para usuarios menos experimentados de la tecnología. Sin embargo, se decidió no investigar la efectividad de la herramienta en este caso, ya que un usuario altamente capacitado organizó la alineación de manera excelente para este documento. Dado que la alineación del bloque con la hoja depende en gran medida del operador, el desarrollo de una herramienta especializada para ayudar a estandarizar este proceso todavía se consideró un paso importante dentro del desarrollo de HistoBrick para que pueda implementarse fácilmente en el futuro.

Los pozos de HistoBrick se diseñaron como una matriz de 96 pozos en una cuadrícula de 1536 para cumplir con los estándares de automatización para plataformas de manejo de líquidos. Si el formato y la colocación de HistoBrick en el diseño de la plataforma fueron exitosos, se encontraron limitaciones para el procedimiento automatizado de transferencia de microtejidos uno a uno. En condiciones ideales, cada microtejido de la placa de 96 pocillos se habría recogido con 2–10 µl de PBS y se habría transferido directamente a HistoBrick, y luego se habría integrado con HistoGel. Sin embargo, solo fue posible seleccionar con éxito microtejidos individuales de una placa ULA de fondo redondo con la aspiración del volumen completo de 200 µl, estando los microtejidos ubicados al azar en el pocillo. Después de habilitar la sedimentación de la muestra en la punta, no se pudo lograr la dispensación parcial de 2 a 10 µl al pocillo HistoBrick. Las condiciones probadas en este trabajo tenían como objetivo probar la transferencia uno a uno utilizando una plataforma de manejo de líquidos estándar, con microtejidos aislados en pozos individuales como entrada. Esas condiciones iniciales se consideraron ingeniosamente como un caso escolar, dado que las plataformas de producción de microtejidos estandarizados a gran escala se basan en un conjunto de microtejidos en un volumen mayor (< 1 ml) o microtejidos aislados en un volumen pequeño (< 100 µl)22. Si bien procesos como el pipeteo de reactivos y el intercambio de medios son operaciones estándar de los sistemas de automatización de laboratorio, la transferencia de modelos de células 3D sigue siendo un desafío. Esto se debe principalmente al posicionamiento preciso de la punta de la pipeta sobre el modelo celular 3D durante la aspiración, que requiere retroalimentación óptica. Sin él, la extracción exitosa del microtejido solo es accesible con un mayor volumen de líquido. Entonces, la dispensación parcial requerida de pequeñas cantidades de líquido (< 20 µl) es difícil, si no imposible, con equipos clásicos. Si bien la bioimpresión de modelos de células 3D es un campo emergente23 y se han demostrado operaciones de selección y colocación de construcciones más grandes24, se puede encontrar poco sobre las operaciones de selección y colocación para la transferencia distinta de modelos de células 3D de un lugar a otro.

En este estudio, HistoBrick proporciona un método fácil de usar, rentable y robusto para la inclusión de muestras con la alineación coplanar de hasta 96 microtejidos. La tecnología asegura una fuerte reducción del número de especímenes perdidos durante el procesamiento histológico, ahorrando así valioso material biológico. El enfoque HistoBrick facilita el análisis de muestras estandarizado mediante microhistología. El uso eficiente de células derivadas de pacientes es clave para promover la implementación generalizada de modelos celulares 3D en investigación y medicina estratificada. La implementación completa del método ahora se basa en el desarrollo de plataformas de manejo de líquidos que permiten la transferencia eficiente de múltiples modelos de células 3D de un material de laboratorio a otro.

Todos los datos descritos en este manuscrito y todos los detalles de los métodos descritos estarán disponibles a pedido del autor correspondiente.

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Los autores agradecen a Jessica Sordet-Dessimoz y su equipo en Histology Core Facility en EPFL por el procesamiento de muestras para histología. Esta investigación fue apoyada por la Agencia Suiza de Innovación bajo el Proyecto Innosuisse 39848.1 IP-LS.

CSEM SA, Jaquet-Droz 1, 2002, Neuchâtel, Suiza

Sarah Heub, Fatemeh Navaee, Daniel Migliozzi, Diane Ledroit, Stéphanie Boder-Pasche, Jonas Goldowsky, Emilie Vuille-Dit-Bille, Vincent Revol & Gilles Weder

Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad de Ciencias Aplicadas y Artes del Noroeste de Suiza, 4132, Muttenz, Suiza

Joëlle Hofer, Carine Gaiser y Laura Suter-Dick

Centro Suizo de Toxicología Humana Aplicada (SCAHT), 4001, Basilea, Suiza

laura suter dick

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

SH concibió la idea de HistoBrick. DM diseñó el molde. FN diseñó las herramientas de corte y alineación. DM y FN realizaron los experimentos de optimización de métodos y gel de hidrogel. FN produjo los microtejidos HepG2 y realizó los experimentos de alineación. JH y CG probaron HistoBrick y contribuyeron a la optimización del protocolo. DM desarrolló el método de procesamiento de imágenes y EV-D.-B. hizo el análisis estadístico del posicionamiento del microtejido. DL y JG investigaron los métodos de transferencia automatizados. SH coordinó la preparación del manuscrito. CG, LS-D., VR, SB-P. y GW evaluaron los datos y revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Sarah Heub.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Heub, S., Navaee, F., Migliozzi, D. et al. Incrustación coplanar de múltiples modelos de células 3D en hidrogel hacia microhistología de alto rendimiento. Informe científico 12, 9991 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-13987-4

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Recibido: 12 enero 2022

Aceptado: 31 de mayo de 2022

Publicado: 15 junio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-13987-4

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