Imágenes de bioluminiscencia in vivo de bacterias naturales dentro de tejidos profundos a través de ATP

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 2331 (2023) Citar este artículo

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La mayoría de los métodos de obtención de imágenes por bioluminiscencia existentes solo pueden visualizar la ubicación de bacterias modificadas in vivo, lo que generalmente excluye la obtención de imágenes de bacterias naturales. En este documento, aprovechamos los transportadores de azúcar de cassette de unión a ATP específicos de bacterias para internalizar la luciferasa y la luciferina al hacer autostop en la fuente única de carbono de las bacterias. Por lo general, las sondas bioluminiscentes sintetizadas están hechas de polímero de glucosa (GP), luciferasa, Cy5 y nanopartículas de silicio modificadas con ICG y sus sustratos están hechos de nanopartículas de silicio modificadas con GP y D-luciferina. En comparación con las bacterias con mutaciones en los transportadores, que difícilmente internalizan las sondas in vitro (es decir, ~2 % de la tasa de absorción), varias bacterias podrían engullir las sondas con fuerza con una alta tasa de absorción de alrededor del 50 %. En particular, la estrategia desarrollada permite obtener imágenes de bioluminiscencia ex vivo del vítreo humano que contiene diez especies de patógenos recolectados de pacientes con endoftalmitis bacteriana. Al usar esta plataforma, diferenciamos aún más la nefritis y la colitis bacterianas y no bacterianas en ratones, mientras que sus contrapartes quimioluminiscentes no pueden distinguirlas.

Los microorganismos tienen muchas funciones vitales en la salud y la enfermedad1,2,3,4,5,6. La actividad bacteriana in vivo está fuertemente influenciada por su ubicación dentro del organismo huésped. Los métodos de imágenes clínicas existentes, como la tomografía computarizada (TC), la resonancia magnética (RM) y pueden proporcionar imágenes no invasivas de infecciones bacterianas en el cuerpo. Sin embargo, debido a su selectividad relativamente baja, no pueden distinguir la inflamación causada por infecciones bacterianas de la inflamación causada por otras causas, como el cáncer o las enfermedades autoinmunes7,8,9,10. Recientemente, las técnicas de imagen óptica pueden proporcionar información bacteriana localizada, cualitativa y cuantitativa a nivel molecular11,12,13,14. Como el método de obtención de imágenes ópticas más utilizado, la obtención de imágenes por fluorescencia requiere una excitación óptica en tiempo real; sin embargo, puede dar lugar a una autofluorescencia de fondo de los tejidos biológicos, lo que da como resultado una relación señal-fondo relativamente baja15,16,17.

Atribuida a la eliminación de una irradiación de luz externa, la imagen por bioluminiscencia (BLI) presenta varias ventajas sobre la imagen por fluorescencia, como un fondo más bajo, mayor sensibilidad18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28. Hasta la fecha, los sistemas bioluminiscentes para la detección de bacterias se pueden categorizar básicamente en dos tipos: (1) el sistema BLI endógeno, que involucra la ingeniería genética de bacterias para expresar luciferasas29,30,31,32,33; (2) el sistema BLI exógeno, en el que la autoluminiscencia proviene de la oxidación de los sustratos de luciferina exógena o luciferina enjaulada catalizada por la luciferasa exógena en presencia de trifosfato de adenosina (ATP) bacteriano producido por la lisis de bacterias34. A pesar del gran progreso de BLI, tiene deficiencias intrínsecas en la imagen bacteriana, como sigue: "primero, los sistemas BLI endógenos necesitan la modificación genética de las bacterias; segundo, los sistemas BLI exógenos necesitan la destrucción de las células bacterianas para consumir el ATP intracelular", por lo que no puede obtener imágenes de bacterias vivas29,30,31,32,33,34.

Una forma teóricamente prometedora pero metodológicamente subdesarrollada de visualizar varias bacterias naturales in vivo con bioluminiscencia es entregar selectivamente un reportero bioluminiscente en las células bacterianas, consumiendo directamente el ATP dentro de las bacterias. Curiosamente, la estrategia antibiótica del "caballo de Troya" podría administrar antibióticos ligados a sideróforos en el citoplasma bacteriano a través de los transportadores de hierro bacterianos35,36,37,38,39,40,41. En nuestro trabajo anterior, hemos demostrado que las nanosondas modificadas con polímero de glucosa (GP) se pueden internalizar en varias bacterias a través de la vía del transportador ABC específica de bacterias, como se resume en la Tabla complementaria 142,43,44,45. Sin embargo, el uso de una estrategia de "caballo de Troya" para entregar selectivamente indicadores bioluminiscentes en bacterias, hasta donde sabemos, no se ha informado antes.

Para llenar el vacío técnico, nos dispusimos a entregar selectivamente luciferasa y luciferina en diversas bacterias naturales a través de transportadores de azúcar de casete de unión a ATP (ABC), haciendo autostop en polímeros de glucosa α (1-4)-glucosidicamente enlazados (equivalente de dextrosa de 4.0 ~7.0) nanopartículas enlazadas. La Figura 1 ilustra esquemáticamente que tanto las bacterias Gram-negativas como las Gram-positivas podrían engullir activamente las sondas bioluminiscentes sintetizadas (es decir, polímero de glucosa (GP), luciferasa, Cy5 y nanopartículas de silicio modificadas con ICG (GP-Si-BP)) y sus sustratos. (GP y nanopartículas de silicio modificadas con D-luciferina (GP-Si-Luc)). La GP (p. ej., poli[4-O-(α-D-glucopiranosil)-D-glucopiranosa]) sirve como fuente de carbono ubicua, que puede internalizarse sólidamente en las células bacterianas a través del transportador de azúcar ABC9,42,46. Usando el transportador de azúcar ABC en Escherichia coli (E. coli) como ejemplo, tiene cinco subunidades: LamB, MalE, MalF, MalG y MalK. Entre estas subunidades, LamB es una porina de difusión de membrana externa típica, y MalE puede reconocer moléculas de GP unidas α (1-4)-glucosídicamente47,48,49,50,51,52,53. Al aprovechar este mecanismo de captación, se ha demostrado recientemente que las nanopartículas modificadas con GP de tamaño pequeño (p. ej., ~5 nm), incluidas las nanopartículas de silicio, las nanopartículas de oro y los puntos de carbono, se internalizan de manera selectiva y sólida en las células bacterianas43,44,45. Análogamente, aquí mostramos que diversas bacterias comen sus 'alimentos' camuflados, es decir, GP-Si-BP y GP-Si-Luc. Después de la internalización en las células bacterianas, la luciferina en GP-Si-Luc es activada directamente por el ATP dentro de las bacterias, seguida de la oxidación catalizada por la luciferasa en GP-Si-BP. Mediante el empleo adicional de un relé de transferencia de energía, que integra la transferencia de energía por resonancia de bioluminiscencia (BRET) entre la luciferasa y Cy5 y la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) entre Cy5 e ICG, las sondas Trojan BLI desarrolladas permiten obtener imágenes de bacterias en el infrarrojo cercano (NIR) dentro de tejidos profundos. Además, la carga de ICG permite la eliminación fototérmica de bacterias bajo irradiación NIR. Demostramos que la estrategia BLI del caballo de Troya presentada permite obtener imágenes de bioluminiscencia ex vivo de diez especies de bacterias en el vítreo de pacientes con endoftalmitis bacteriana. También demostramos que la estrategia BLI del caballo de Troya presentada permite no solo imágenes selectivas y sensibles, sino también terapia fototérmica de patógenos en tejidos profundos, en modelos de prueba de concepto de nefritis y colitis bacteriana en ratones.

Las nanosondas están hechas de GP, Cy5, ICG y nanopartículas de silicio modificadas con luciferasa (SiNP) (GP-Si-BP) y GP, SiNP modificadas con D-luciferina (GP-Si-Luc).

La Fig. 1 complementaria ilustra la ruta sintética para GP-Si-BP y GP-Si-Luc paso a paso. Brevemente, primero sintetizamos SiNP conjugados con GP (GP-SiNP) a través de la reacción de la base de Schiff, en la que se formó la base de Schiff en función de la reacción entre los grupos aldehído de GP (0,56 mM, 100 µL) y los grupos amino en el superficie de SiNP (0,08 mM, 200 l). A continuación, aprovechando la adsorción electrostática, las moléculas de colorante de Cy5 (0,56 mM, 2 µL) e ICG (0,56 mM, 12 µL) se adsorbieron en GP-SiNP. Mediante la conjugación adicional con luciferasa de luciérnaga (0,06 mM, 100 µL) a través de la reacción de condensación activada por clorhidrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etil-carbodiimida (EDC)/N-hidroxisuccinimida (NHS), finalmente obtuvimos las sondas bioluminiscentes de GP-Si-BP. Análogamente, mediante la conjugación de GP-SiNP con D-luciferina (0,30 mM, 100 μl) según la reacción de condensación de EDC/NHS, sintetizamos los sustratos bioluminiscentes de GP-Si-Luc. El rendimiento químico de GP-Si-BPs fue de 76,1 % y el rendimiento químico de GP-Si-Luc fue de 78,8 %, los cuales se calcularon de acuerdo con el protocolo informado54. Las cantidades de GP, Cy5, ICG, luciferasa, D-luciferina cargadas en SiNP se cuantificaron estrictamente mediante las curvas de absorción de calibración correspondientes (Fig. 2 complementaria). Por lo general, la cantidad real de Cy5 adsorbida en las GP-SiNP fue ~0,0044 mM, y la cantidad real de ICG adsorbida en las GP-SiNP fue ~0,026 mM. Para obtener la dosis equivalente, la absorbancia detectada de Cy5 e ICG debe mantenerse igual entre los grupos.

Como se revela en las imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) y la imagen TEM de alta resolución de SiNP, GP-Si-BP y GP-Si-Luc (Fig. 2a) y la distribución de tamaño correspondiente (Fig. 3 complementaria), el promedio el diámetro de los GP-Si-BP fue de ~2,8 nm y el diámetro promedio de GP-Si-Luc fue de ~2,9 nm, siendo ambos ligeramente mayores que los de las SiNP desnudas (p. ej., ~2,2 nm). El diámetro hidrodinámico de GP-Si-BP, GP-Si-Luc y SiNP puro fue ~ 5.6 nm, ~ 4.1 nm y ~ 3.1 nm, medido por dispersión de luz dinámica (DLS) (Fig. 4 complementaria). El tamaño de partícula medido por DLS es ligeramente mayor que el de TEM, lo que puede deberse a diferentes estados superficiales de la misma muestra en las dos condiciones de medición. Específicamente, el solvente en la muestra debe eliminarse estrictamente para la caracterización TEM, lo que arroja un diámetro más pequeño que el medido por DLS, como se discutió en informes anteriores55,56. Además, hemos demostrado sistemáticamente la buena estabilidad de la luciferasa y la luciferina después de la conjugación de SiNP (Fig. 5 complementaria).

a Imágenes TEM e imágenes TEM de alta resolución de SiNP, GP-Si-BP y GP-Si-Luc. Barra de escala, 20 nm y 1 nm. b Imágenes de TEM de exploración de campo oscuro anular de ángulo alto (HAADF-STEM) de MDR E. coli o MRSA tratadas con PBS, 0,06 mM de Si-BP, Si-Luc, GP-Si-Luc, GP-Si-BP a 37 oC durante 2,5 h. Después de la incubación, las bacterias tratadas se enjuagaron con tampón PBS varias veces. La concentración de células bacterianas es ~1,0 × 107 CFU. Barra de escala, 200 nm. c Señales bioluminiscentes de MDR E. coli con diferentes tratamientos como se indica. Después de la incubación, las bacterias tratadas se enjuagaron con tampón PBS varias veces, seguido de imágenes (IVIS Lumina III). Todos los experimentos de formación de imágenes se repitieron tres veces con resultados similares. El análisis estadístico se realizó utilizando un análisis ANOVA de una vía. Los datos se presentan como valores medios +/− DE (n = 3). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. Las caricaturas son creadas por el Prof. Houyu Wang.

Para interrogar principalmente si GP-Si-BP y GP-Si-Luc podrían ingresar a las bacterias naturales, se aislaron dos células de Escherichia coli multirresistente (MDR E. coli) derivadas clínicamente y de Staphylococcus aureus multirresistente (MRSA) para los siguientes experimentos Se obtuvieron de pacientes con queratitis que fueron diagnosticados y tratados en el Hospital de Ojos, Oídos, Nariz y Garganta de Shanghái, Universidad de Fudan. Las cepas aisladas (~1,0 × 107 CFU) se incubaron con GP-Si-BP (0,06 mM), GP-Si-Luc (0,06 mM) a 37 °C durante 2,5 h y luego se lavaron con tampón PBS varias veces. Las imágenes del microscopio electrónico de barrido (SEM) en la Fig. 6 complementaria mostraron que la superficie y la morfología de las células MDR E. coli y MRSA tratadas eran comparables a las no tratadas. Como se muestra en el mapeo elemental en imágenes de microscopio electrónico de transmisión de barrido de campo oscuro anular de alto ángulo (HAADF-STEM) (Fig. 2b), los elementos de carbono, nitrógeno y oxígeno aparecieron en cada grupo, mientras que los elementos de silicio existían solo en las bacterias tratadas con GP-Si-BPs o GP-Si-Luc. Aparentemente, las señales de silicio observadas se asignaron a SiNP en GP-Si-BP o GP-Si-Luc, lo que demuestra directamente la internalización de GP-Si-BP o GP-Si-Luc en células bacterianas. Finalmente, el BLI ex vivo de las bacterias tratadas reveló que la luminiscencia distintiva solo se encontró en el grupo GP-Si-BPs + GP-Si-Luc, que fue alrededor de ~ 10 veces más fuerte que otros grupos (Fig. 2c). El alto brillo se debió a la cantidad de ATP, que era necesaria para activar la luciferina en la reacción de emisión de luz mediada por luciferasa, exactamente unas 10 veces mayor dentro de las bacterias que fuera (Fig. 7 complementaria). El contenido de ATP se determinó mediante el kit de ensayo de ATP. Curiosamente, se observaron señales bioluminiscentes comparables en las bacterias lisadas al agregar sondas sin modificar las moléculas de GP (Si-BPs + Si-Luc) (Fig. 2c). También tratamos las bacterias con el inhibidor ATP de DCC (diciclohexilcarbodiimida) antes de la incubación con GP-Si-BPs + GP-Si-Luc. Como se esperaba, no aparecieron señales distintas (Fig. 8 complementaria). Estos resultados en conjunto demostraron que las sondas Trojan BLI construidas realmente ingresaron a las bacterias, y el brillo de la bioluminiscencia producida dependía de la cantidad de ATP dentro de las bacterias.

En las sondas bioluminiscentes desarrolladas, los SiNP centrales sirvieron como vectores para cargar indicadores bioluminiscentes. Los indicadores bioluminiscentes incluyeron la fuente de autoluminiscencia de luciferasa (λem = 560 nm) y dos tintes orgánicos de Cy5 (λex = 646 nm, λem = 664 nm) e ICG (λex = 780 nm, λem = 840 nm) (Fig. 3a). Beneficiada de la superposición suficiente en las bandas de emisión y absorción, la emisión NIR se puede lograr en base a un proceso de relé de transferencia de energía de resonancia dual, combinando BRET entre luciferasa y Cy5, y FRET entre Cy5 e ICG (Fig. 3b). Como se revela con más detalle en la Fig. 3c, cuando la proporción de Cy5 a ICG fue de 1:6, se puede lograr la mayor eficiencia de transferencia de energía. Por lo general, se determinó que la eficiencia óptima de FRET entre Cy5 e ICG era del 32 % y se calculó que la distancia de Förster correspondiente (R0) era de 1,03 nm, lo que garantiza la emisión eficiente en la región NIR. Como se revela en la Fig. 3d, la intensidad bioluminiscente de GP-Si-BPs + GP-Si-Luc mejoró linealmente con el aumento de la concentración de ATP, lo que sugiere una forma dependiente del contenido de ATP de GP-Si-BPs. Tras la adición de D-Luciferina (150 µM) y ATP (10 µM), se probó más la fotoestabilidad de GP-Si-BP (0,06 mM). Como se revela en la Fig. 3e, el sistema BLI exhibió una estabilidad de bioluminiscencia relativamente buena, reteniendo el 84 % de la señal normalizada después de 120 min debido a que la reacción enzimática entre la luciferina y la luciferasa se mantuvo estable ya que no se vio afectada por la energía externa (p. ej., irradiación de luz ). Por el contrario, la señal normalizada de ICG en GP-Si-BP disminuyó drásticamente en un 26 % bajo una irradiación continua de 808 nm durante 120 min porque la irradiación continua de 808 nm a ICG fue responsable del posible efecto de blanqueo y extinción de la emisión reducida. Posteriormente, examinamos la profundidad de penetración en el tejido de GP-Si-BP. Experimentalmente, GP-Si-BP (0,06 mM) mezclado con D-Luciferin (150 µM) y ATP (10 µM) en una placa negra de 96 pocillos se cubrió con tejido de pechuga de pollo con varios espesores, seguido de la grabación de señales bioluminiscentes y señales fluorescentes bajo irradiación de 808 nm. Como se revela en la Fig. 3f, la señal bioluminiscente normalizada disminuyó junto con el aumento del grosor del tejido de la pechuga de pollo que va de 0 a 35 mm. Por lo general, cuando el grosor era de hasta 30 mm, la intensidad bioluminiscente normalizada de los GP-Si-BP seguía siendo significativamente mayor que la del grupo de imágenes de emisión NIR basado en ICG (p < 0,0001). De manera análoga, la profundidad de penetración en el tejido de GP-Si-BP fue significativamente mayor que la de GP-Ce6-SiNP, como se indica en la Fig. 9 complementaria. Por lo general, cuando el grosor era de 5 mm, la señal fluorescente de GP-Ce6-SiNPs era indetectable. Las buenas profundidades de penetración de GP-Si-BP sientan las bases para las posteriores aplicaciones de imágenes in vivo en tejidos profundos. Finalmente, probamos la capacidad fototérmica de GP-Si-BP in vitro utilizando una cámara termográfica IR. Como se muestra en la Fig. 3g, h, la temperatura de la solución de GP-Si-BPs (0,06 mM) podría subir rápidamente a 61 oC bajo irradiación láser de 808 nm durante 5 min, lo que sugiere la potencial terapia fototérmica (PTT) de GP-Si -BPs contra bacterias.

un espectro de emisión y absorción UV-vis de Cy5, ICG y bioluminiscencia de luciferasa. Las líneas discontinuas y continuas se refieren a los espectros de absorción y emisión, respectivamente. b Un esquema que ilustra el mecanismo de un relé de transferencia de energía que integra BRET y FRET en la estrategia desarrollada. c Espectros de fluorescencia de GP-Si-BP con diferentes proporciones de Cy5 a ICG. d Señales bioluminiscentes de GP-Si-BPs + GP-Si-Luc en función de la concentración de ATP (media ± SD, n = 3). e, f Imágenes de bioluminiscencia y fluorescencia (excitación: 780 nm) resueltas en el tiempo (e) y dependientes del grosor del tejido de pechuga de pollo (f) y la señal normalizada correspondiente para la comparación cuantitativa del cambio de señal de bioluminiscencia y fluorescencia. La señal normalizada en (e) se define como la relación entre la intensidad de emisión detectada en cualquier momento y la intensidad de emisión detectada a los 5 min. La señal normalizada en (f) se define como la relación entre la intensidad de emisión detectada en cualquier espesor de tejido y la intensidad de emisión detectada a 0 mm. La bioluminiscencia se produce por la mezcla de GP-Si-BPs (0,06 mM), D-luciferina (150 µM) y ATP (10 µM). Los datos se presentan como valores medios +/− DE (n = 3). g Las imágenes de calentamiento fototérmico de PBS, GP-Si-BP bajo la irradiación de un láser de 808 nm. h Las curvas de calentamiento fototérmico de PBS, GP-Si-BP bajo la irradiación de un láser de 808 nm. Todos los experimentos de formación de imágenes se repitieron tres veces con resultados similares. El análisis estadístico se realizó utilizando un análisis ANOVA de una vía. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para optimizar la cantidad de GP vinculado y el tiempo de incubación, se investigó sistemáticamente la eficiencia de absorción de GP-Si-BP por bacterias mediante análisis de citometría de flujo. Como se revela en la Fig. 10 complementaria, la tasa de absorción de ~1,0 × 107 CFU de MDR E. coli alcanzó su valor máximo (p. ej., 48,5 % de MRSA y 48,8 % de MDR E. coli) cuando las bacterias se incubaron con el GP-Si-BP que contenían una concentración de GP de 0,56 mM durante 2,5 h. La tasa de absorción no mejoró significativamente al aumentar aún más la concentración de GP y el tiempo de incubación, lo que indica que se ha logrado un estado de saturación en esta circunstancia. También se observaron tendencias similares en GP-Si-Luc. En consecuencia, se emplearon GP 0,56 mM y 2,5 h de incubación en los siguientes experimentos.

A continuación, demostramos si GP-Si-BPs y GP-Si-Luc podrían dirigirse a varias bacterias naturales. Con este fin, seleccionamos dos bacterias Gram-negativas, es decir, E. coli MDR de origen clínico, Salmonella typhimurium (STm) y dos bacterias Gram-positivas, es decir, MRSA y Staphylococcus aureus (S. aureus) de origen clínico. Como se revela en las imágenes de microscopía de escaneo láser confocal (CLSM) en la Fig. 4a y la Fig. 11a complementaria, pudimos observar las distintas señales fluorescentes rojas (asignadas a ICG, λex = 780 nm, λem = 800-840 nm) en MRSA, MDR E. coli, S. aureus y STm tras 2,5 h de incubación con GP-Si-BPs (0,06 mM). Cuantitativamente, la citometría de flujo correspondiente reveló que la eficiencia de absorción de GP-Si-BPs fue del 52,7 % por MRSA, 49,6 % por MDR E. coli, 53,5 % por S. aureus y 47,1 % por STm, respectivamente. Análogamente, pudimos detectar fuertes señales fluorescentes verdes (asignadas a D-luciferina, primera columna, λex = 328 nm, λem = 530–560 nm) en MRSA, MDR E. coli, S. aureus y STm después de 2,5 h de incubación con GP-Si-Luc (0,06 mM) (Fig. 4b y Fig. 11b complementaria). Además, se determinó la eficiencia de captación relativamente alta de GP-Si-Luc en MRSA (48,1 %), MDR E. coli (45,7 %), S. aureus (47,2 %) y STm (48,9 %) respectivamente. Como era de esperar, se pueden observar señales verdes y rojas en MRSA, E. coli MDR, S. aureus y STm tratados con GP-Si-BP (0,06 mM) y GP-Si-Luc (0,06 mM) (GP-Si -BPs + GP-Si-Luc) durante 2,5 h (Fig. 4c y Fig. 11c complementaria). Por el contrario, no podemos observar señales fluorescentes detectables en las bacterias tratadas con los nanoagentes sin la modificación de las moléculas GP (es decir, Si-Luc, Si-BP o Si-Luc + Si-BP) (Figs. 12 y 12 complementarias). 13). Estos resultados confirmaron principalmente la capacidad de los ligandos de GP para dirigirse a las bacterias.

a Imágenes de fluorescencia confocal de MRSA o MDR E. coli después de la incubación con GP-Si-BP 0,06 mM y el correspondiente análisis de citometría de flujo de las tasas de captación. b Imágenes de fluorescencia confocal de MRSA o MDR E. coli después de la incubación con GP-Si-Luc 0,06 mM y el correspondiente análisis de citometría de flujo de las tasas de captación. c Imágenes de fluorescencia confocal de MRSA o E. coli MDR después de la incubación con GP-Si-Luc + GP-Si-BP 0,06 mM. d, e Imágenes de fluorescencia confocal de bacterias mutantes de ΔlamB y ΔmalE después de la incubación con GP-Si-BP 0,06 mM (d) o GP-Si-Luc (e). La concentración de células bacterianas es ~107 CFU. Barra de escala, 25 μm. f Imágenes de bioluminiscencia de tampón PBS que contiene MRSA o MDR E. coli con diferentes concentraciones después de la incubación con GP-Si-Luc + GP-Si-BP 0,06 mM. g Imágenes de bioluminiscencia ex vivo de vítreo humano que contiene Enterococcus faecalis (1), Klebsiella pneumoniae (2), Streptococcus pneumoniae (3), Neisseria meningitidis (4), Haemophilus influenzae (5), Streptococcus pyogenes (6), vancomicina (Van)- Enterococcus resistente (7), Staphylococcus aureus multirresistente (MRSA) (8), Moraxella catarrhalis (9) o Salmonella para-typhi A (10) recolectados de pacientes con endoftalmitis bacteriana. El vítreo sin bacterias (0) de un voluntario sano se estableció como control. Todos los experimentos de formación de imágenes se repitieron tres veces con resultados similares.

Para demostrar aún más si GP-Si-BP y GP-Si-Luc se dirigieron a bacterias a través del transportador de azúcar ABC, construimos dos tipos de mutantes bacterianos, es decir, un mutante de eliminación para delta-lamB (ΔlamB) y un mutante de eliminación para delta-malE (ΔmalE), seguido de incubación con GP-Si-BPs o GP-Si-Luc. Los datos de secuenciación de Sanger (Notas complementarias) junto con los datos de PCR (Figura 14 complementaria) verificaron la construcción exitosa de ΔlamB y ΔmalE. Como era de esperar, no observamos ninguna señal fluorescente en ΔlamB o ΔmalE tratados con GP-Si-BP (Fig. 4d) o GP-Si-Luc (Fig. 4e). Los resultados de la citometría de flujo coincidieron con las imágenes CLSM (Fig. 15 complementaria). Además, investigamos más a fondo si los diferentes azúcares (por ejemplo, GP, glucosa y maltotriosa) afectarían la absorción de GP-Si-BP por los transportadores de azúcar ABC. Como se revela en la Fig. 16 complementaria, la absorción de GP-Si-BP fue inhibida por un exceso de GP o maltotriosa en lugar de glucosa. Como se informó anteriormente, los transportadores de azúcar ABC permitieron el transporte no solo de maltosa sino también de polímeros de glucosa enlazados linealmente (1-4)-glucosídicamente, como maltodextrinas, amilosa y almidón, así como ciclodextrinas enlazadas (1-4)-glucosídicamente57, 58. Estos resultados en conjunto demostraron que el mecanismo de absorción de las sondas Trojan BLI en las bacterias fue de hecho a través de la vía del transportador de azúcar ABC.

Finalmente, demostramos la buena especificidad de GP-Si-BPs y GP-Si-Luc para bacterias sobre células de mamíferos. Normalmente, las muestras de sangre humana enriquecidas con MDR E. coli o MRSA se incubaron con GP-Si-BP (0,06 mM), GP-Si-Luc (0,06 mM) o GP-Si-BP + GP-Si-Luc (0,06 mM ) durante 2,5 h y luego se lavó con tampón PBS. Como se indica en la Fig. 17 complementaria, las señales de fluorescencia verde y roja solo se observaron en células bacterianas en lugar de en células sanguíneas humanas. Estos resultados demostraron que las células de mamífero apenas internalizaron GP-Si-BP o GP-Si-Luc debido a la ausencia de transportadores de azúcar ABC en las células de mamífero.

Para determinar el límite de detección, tomamos imágenes de una serie de concentraciones de MRSA y MDR E. coli en tampón PBS incubado con sondas Trojan BLI (Fig. 4f). Por lo general, las bacterias en concentraciones tan bajas como ~106 CFU produjeron una señal detectable. Sobre esta base, demostramos además que la estrategia BLI del caballo de Troya presentada permitía la obtención de imágenes por bioluminiscencia ex vivo de diez tipos de patógenos en el vítreo recolectados de pacientes con endoftalmitis bacteriana, y los patógenos fotografiados eran Enterococcus faecalis, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pyogenes, Enterococcus resistente a la vancomicina (Van), Staphylococcus aureus resistente a múltiples fármacos (MRSA), Moraxella catarrhalis y Salmonella para-typhi A, como se revela en la Fig. 4g. Estos patógenos fueron confirmados por cultivo bacteriano, también proporcionado por el Hospital de Ojos, Oídos, Nariz y Garganta de Shanghái, Universidad de Fudan. Estos resultados implicaron el potencial de la estrategia BLI del caballo de Troya en el diagnóstico bacteriano clínico.

A continuación, testificamos la viabilidad de la estrategia propuesta sobre imágenes bioluminiscentes de bacterias naturales en tejidos profundos. Con este fin, primero construimos un modelo de prueba de concepto de nefritis inducida por S. aureus en ratones (Fig. 18a complementaria). La concentración real de S. aureus en el sitio de infección durante la obtención de imágenes fue ~1,0 × 108 CFU. Encontramos que las señales de bioluminiscencia más fuertes aparecieron en los sitios infectados solo en los grupos GP-Si-BPs + GP-Si-Luc (Fig. 5a). Cuantitativamente, la intensidad de la señal en los grupos GP-Si-BPs + GP-Si-Luc fue ~3 veces más fuerte que en los grupos GP-Si-BPs + Si-Luc. También pudimos observar resultados similares en las imágenes ex vivo de los tejidos renales recolectados (Fig. 19 complementaria). Además, la estrategia troyana desarrollada (Fig. 5b) podría discriminar tan solo ~1,0 × 106 CFU de S. aureus en el riñón, y dicha sensibilidad debería ser suficiente para muchos escenarios in vivo. Para demostrar la imagen selectiva de la estrategia Trojan BLI desarrollada contra la nefritis bacteriana sobre otra nefritis, a continuación construimos colitis causada por glicerina en ratones (Fig. 18b complementaria). Como era de esperar, encontramos que las señales bioluminiscentes en ratones con nefritis por S. aureus tratados con GP-Si-BPs + GP-Si-Luc eran significativamente más brillantes que el control y los ratones con nefritis por glicerina tratados con GP-Si-BPs + GP-Si-Luc (p < 0,001) (fig. 5c). Para una comparación adicional, también utilizamos otro reactivo de autoluminiscencia de luminol para obtener imágenes de ratones con nefritis por S. aureus (Fig. 18c complementaria) o ratones con nefritis por glicerina (Fig. 18d complementaria). Como se informó anteriormente, el luminol podría ser catalizado por la mieloperoxidasa (MPO) para producir luminiscencia59,60. Distinguido de la estrategia Trojan BLI desarrollada en la imagen selectiva de la nefritis por S. aureus, el luminol podría producir fuertes señales luminiscentes tanto en ratones con nefritis por S. aureus como en ratones con nefritis por glicerina (Fig. 5d). Estos resultados juntos demostraron que la estrategia Trojan BLI desarrollada podía discriminar entre la nefritis bacteriana y otras nefritis. La alta selectividad, así como la sensibilidad ajustable de la estrategia desarrollada, se atribuyó a la internalización selectiva de las sondas Trojan BLI en las células bacterianas. Además, comparamos sistemáticamente el sistema SiNP modificado con GP y Ce6 (GP-Ce6-SiNP) informado anteriormente (simplemente excitación de Ce6) 39, el sistema Trojan BLI y la emisión de imágenes NIR basada en ICG en la imagen de la nefritis por S. aureus ( Figura complementaria 20). Aunque el sistema GP-Ce6-SiNPs y las imágenes de emisión NIR basadas en ICG permitieron la detección de la captación bacteriana de nanoagentes en el riñón debido a la capacidad de localización bacteriana específica de los ligandos GP, la estrategia Trojan BLI presentaba una relación señal/ruido 3,75 veces mayor que la obtenida por el sistema GP-Ce6-SiNPs y relaciones señal/ruido 3,46 veces más altas que las obtenidas por imágenes de emisión NIR basadas en ICG. En conjunto, utilizamos Trojan BLI en lugar de imágenes de emisión basadas en Ce6 o ICG en la detección de nefritis por S. aureus debido a las imágenes de alto contraste del sistema Trojan BLI.

a Imágenes de bioluminiscencia de nefritis inducida por S. aureus (~1,0 × 108 CFU) en ratones con diferentes tratamientos como se indica. Los ratones infectados fueron inyectados con GP-Si-BPs + PBS, GP-Si-BPs + Si-Luc, GP-Si-BPs + GP-Si-Luc, Si-BPs, GP-Si-Luc y Si-BPs + Si-Luc a la misma dosis respectivamente (media ± DE, n = 3). b Imágenes de bioluminiscencia de nefritis inducida por S. aureus (~1,0 × 106 CFU) en ratones con diferentes tratamientos como se indica. Los ratones infectados fueron inyectados con GP-Si-BPs + PBS, GP-Si-BPs + Si-Luc, GP-Si-BPs + GP-Si-Luc, Si-BPs, GP-Si-Luc y Si-BPs + Si-Luc a la misma dosis, respectivamente (media ± SD, n = 3). c Imágenes de bioluminiscencia de ratones sanos (control), ratones con nefritis por glicerina y ratones con nefritis por S. aureus mediante el uso de sondas Trojan BLI (media ± DE, n = 3). d Imágenes de luminiscencia de ratones sanos (control), ratones con nefritis por glicerina y ratones con nefritis por S. aureus mediante administración intraperitoneal de luminol (282 mM, 200 μL) (media ± DE, n = 3). Todos los experimentos de formación de imágenes se repitieron tres veces con resultados similares. El análisis estadístico se realizó utilizando un análisis ANOVA de una vía. Las barras de error representan la desviación estándar obtenida de tres mediciones independientes. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para confirmar la generalidad de la estrategia desarrollada en la obtención de imágenes de bacterias naturales en tejidos profundos, construimos otro modelo de prueba de concepto de colitis inducida por STm en ratones (Fig. 21a complementaria). La cantidad real de STm en el sitio de infección durante la obtención de imágenes se determinó como ~1,0 × 109 CFU. Como se revela en la Fig. 6a, observamos señales bioluminiscentes mucho más fuertes en los grupos GP-Si-BPs + GP-Si-Luc que en otros grupos (p <0.0001). Se observaron resultados consistentes en las imágenes ex vivo de los tejidos intestinales aislados (Fig. 6b). Para testificar la selectividad de la estrategia Trojan BLI desarrollada contra la colitis bacteriana sobre otras colitis, construimos colitis inducida por sulfato de dextrano sódico (DSS) en ratones (hembra, 6 a 8 semanas de edad, n = 3) (Fig. 21b complementaria). Los ratones portadores de colitis DSS se trataron con GP-Si-BPs + GP-Si-Luc en condiciones idénticas. De hecho, las señales bioluminiscentes en los grupos STm tratados con GP-Si-BPs + GP-Si-Luc fueron significativamente más fuertes que los grupos control y DSS tratados con GP-Si-BPs + GP-Si-Luc (p < 0,001) (Fig. 6c). También empleamos luminol para obtener imágenes de ratones con colitis STm (Fig. 21c complementaria) o ratones con colitis DSS (Fig. 21d complementaria) para una comparación adicional. Como era de esperar, en comparación con las señales ignorables en los grupos de control, observamos fuertes señales luminiscentes tanto en ratones con colitis STm tratados con luminol (p < 0,0001) como en ratones con colitis DSS tratados con luminol (p < 0,01) (Fig. 6d) . Estos resultados juntos demostraron que la estrategia Trojan BLI desarrollada podía discriminar entre colitis bacteriana y otras colitis. También demostramos que la estrategia Trojan BLI desarrollada permitió una imagen a largo plazo y en tiempo real de la colitis STm en ratones (Fig. 6e). Por lo general, todavía pudimos observar distintas señales 1 hora después de la administración de GP-Si-Luc. Esta luminiscencia persistente observada junto con la buena especificidad se atribuyó a la acumulación selectiva de sondas Trojan BLI en las células bacterianas de los tejidos intestinales infectados. Además, comparamos sistemáticamente el sistema GP-Ce6-SiNPs (simplemente excitación de Ce6) 42, la estrategia Trojan BLI y las imágenes de emisión NIR basadas en ICG en la imagenología de la colitis STm (Fig. 22 complementaria). Como era de esperar, la estrategia Trojan BLI presentaba relaciones señal/ruido 4,05 veces más altas que las obtenidas por el sistema GP-Ce6-SiNPs y relaciones señal/ruido 3,45 veces más altas que las obtenidas por imágenes de emisión NIR basadas en ICG. Por lo tanto, utilizamos Trojan BLI en lugar de imágenes de emisión basadas en Ce6 o ICG en la detección de colitis STm debido a las imágenes de alto contraste del sistema Trojan BLI.

a Imágenes de bioluminiscencia de colitis inducida por STm (~1,0 × 109 CFU) en ratones con diferentes tratamientos, como se indica. Los ratones infectados fueron inyectados con GP-Si-BPs + PBS, GP-Si-BPs + Si-Luc, GP-Si-BPs + GP-Si-Luc, Si-BPs, GP-Si-Luc y Si-BPs + Si-Luc a la misma dosis respectivamente (media ± DE, n = 3). b Imágenes luminiscentes ex vivo correspondientes de tejidos intestinales aislados de ratones portadores de colitis STm con diferentes tratamientos como se indica. c Imágenes de bioluminiscencia de ratones sanos (control), ratones portadores de colitis DSS y ratones portadores de colitis STm basados ​​en las sondas Trojan BLI (media ± DE, n = 3). d Imágenes de luminiscencia de ratones sanos (control), ratones con colitis DSS y ratones con colitis STm mediante administración intraperitoneal de luminol (282 mM, 200 μL) (media ± DE, n = 3). e Imágenes bioluminiscentes de lapso de tiempo de colitis inducida por STm (~1,0 × 109 CFU) en ratones basadas en las sondas Trojan BLI. Todos los experimentos de formación de imágenes se repitieron tres veces con resultados similares. El análisis estadístico se realizó utilizando un análisis ANOVA de una vía. Las barras de error representan la desviación estándar obtenida de tres mediciones independientes. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Además de las imágenes de bioluminiscencia de bacterias, los GP-Si-BP construidos también poseían el potencial para inactivar bacterias debido a los efectos fototérmicos originados por ICG en GP-Si-BP. Como se revela en imágenes SEM de bacterias (p. ej., E. coli, S. aureus) (Fig. 23a complementaria), observamos células bacterianas arrugadas o lisadas solo en los grupos en los que las bacterias se incubaron con GP-Si-BP (0,06 mM) durante 2,5 h y luego se irradió con un láser de 808 nm (1,0 W cm-2) durante 5 min. Hemos mostrado la evidencia sólida que destaca la superioridad de los GP-Si-BP en comparación directa con los antibióticos utilizados clínicamente (p. ej., vancomicina (Van), ampicilina (Ampi)) (Fig. 23b complementaria). En general, la estrategia presentada tiene dos claras ventajas sobre los antibióticos para matar bacterias: (1) los GP-Si-BP pueden matar bacterias grampositivas y gramnegativas, mientras que la vancomicina solo funciona para bacterias grampositivas (p. S. aureus, M. luteus y MRSA); (2) la estrategia desarrollada muestra índices antibacterianos dominantes (p. ej., >90 %) durante un tratamiento de corta duración (p. ej., 2 h y 30 min), mientras que la vancomicina o la ampicilina, incluso a 15 µg mL−1, muestran índices antibacterianos inferiores, incluso el el tiempo de tratamiento es de hasta 7 h (p. ej., <65%) (Figuras complementarias 23c y 23d). Estos resultados demuestran de manera convincente la utilidad de tales tratamientos para matar bacterias sobre los antibióticos.

Para evaluar la capacidad antibacteriana de la estrategia desarrollada in vivo, examinamos su eficacia fototérmica en el modelo de prueba de concepto de nefritis bacteriana en ratones (Fig. 24 complementaria). También extirpamos los tejidos renales infectados después del tratamiento, seguido de homogeneización y cultivo de los homogeneizados en placas. Como se revela en la Fig. 7a, b, encontramos colonias esporádicas en el grupo de GP-Si-BPs + láser de 808 nm después de 7 días de tratamiento. Cuantitativamente, se calculó que la tasa antibacteriana in vivo de GP-Si-BP bajo irradiación láser contra S. aureus era del 96,0 %. En línea con los experimentos en placas de agar, los datos de tinción con hematoxilina-eosina (H&E) (Fig. 7c) mostraron que la textura clara del tejido y la ausencia de necrosis celular se encontraron solo en el grupo de láser GP-Si-BPs + 808-nm. Los efectos de PPT contribuyeron a las altas tasas antibacterianas. Utilizamos una cámara termográfica IR para registrar las imágenes fototérmicas in vivo. Como se muestra en la Fig. 7d, el rápido aumento de la temperatura solo se produjo en el grupo de láser GP-Si-BPs + 808 nm. En particular, la temperatura del riñón podría aumentar a 52 oC después de 5 minutos de irradiación en este grupo. Mientras tanto, la estrategia Trojan BLI desarrollada también permitió la visualización dinámica del efecto antibacteriano en ratones. Experimentalmente, a los ratones se les inyectó por vía intraperitoneal la misma dosis de GP-Si-Luc después de cada irradiación, seguido de imágenes de bioluminiscencia para evaluar el efecto curativo. Como se muestra en la Fig. 7e, las señales de bioluminiscencia disminuyeron gradualmente a medida que avanzaba el tratamiento. Como se esperaba, la tendencia de cambio en las señales de bioluminiscencia fue consistente con la tendencia de cambio en el recuento bacteriano después del tratamiento. A través del análisis cuantitativo, encontramos que las señales BLI dependientes de la concentración bacteriana eran un indicador importante para la detección y el tratamiento. Estos datos terapéuticos juntos demostraron la capacidad antibacteriana adaptable de la estrategia desarrollada in vivo.

a, b Homogeneizados de riñón infectado en ratones con nefritis tratados con PBS o GP-Si-BP con o sin irradiación (con irradiación de láser de 808 nm, 1,0 W cm−2, 5 min) 7 días después de la inyección cultivadas en agar LB sólido (a) y la correspondiente cuantificación de la colonización bacteriana (media ± DE, n = 3 muestras biológicamente independientes) (b). c Imágenes histológicas correspondientes de tejidos renales infectados con S. aureus de ratones con diferentes tratamientos como se indica. Barra de escala, 25 μm. d, Imágenes fototérmicas representativas de ratones portadores de nefritis por S. aureus tratados con PBS o GP-Si-BP con o sin irradiación (con irradiación de láser de 808 nm, 1,0 W cm−2, 5 min) a los 7 días posteriores a la inyección. e Imágenes de bioluminiscencia de ratones con nefritis por S. aureus en diferentes momentos de tratamiento utilizando sondas Trojan BLI y la relación correspondiente entre el cambio en la intensidad de la bioluminiscencia a lo largo del tiempo y el cambio en el recuento bacteriano a lo largo del tiempo mediante comparación cuantitativa. Después de cada irradiación, a los ratones se les inyectó por vía intraperitoneal la misma dosis de GP-Si-Luc para obtener imágenes para evaluar el efecto curativo (media ± SD). Todos los experimentos de formación de imágenes se repitieron tres veces con resultados similares. El análisis estadístico se realizó utilizando un análisis ANOVA de una vía. Las barras de error representan la desviación estándar obtenida de tres mediciones independientes. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

En última instancia, investigamos sistemáticamente la toxicidad de GP-Si-BP y GP-Si-Luc. Como se revela en la Fig. 25 complementaria, las morfologías de las células HEK-293T, mREC, HeLa o MCF-7 apenas cambiaron cuando se incubaron con GP-Si-BPs + GP-Si-Luc (0,06 mM). Además, la viabilidad celular de estas células se mantuvo por encima del 80 % mediante el uso de ensayos de metil tiazolil tetrazolio (MTT). Estos resultados sugieren la débil citotoxicidad de GP-Si-BP y GP-Si-Luc. Usamos bioquímica sanguínea y análisis de sangre de rutina para probar la toxicidad sistemática de GP-Si-BP y GP-Si-Luc a la dosis probada. Como se muestra en las Tablas complementarias 2 y 3, en comparación con el grupo PBS, todos los indicadores bioquímicos en el grupo GP-Si-BPs o el grupo GP-Si-Luc estaban dentro del rango normal. Además, también realizamos H&E (Fig. 26a complementaria) y tinción tricrómica de Masson (Fig. 26b complementaria) de los órganos principales extraídos de los ratones después de 1 día de inyección intravenosa de GP-Si-BP (0,06 mM) o GP-Si- Luc (0,06 mM). Juntos, no encontramos anormalidades histopatológicas obvias en las secciones de los órganos resecados, lo que indica la toxicidad in vivo insignificante de GP-Si-BP o GP-Si-Luc. Como se reveló además en imágenes de fluorescencia ex vivo de órganos principales resecados de ratones sanos después de la inyección intravenosa de GP-Si-BP (Fig. 27a complementaria), se observaron señales de fluorescencia brillante principalmente en el hígado y el riñón en lugar de otros órganos a las 2 h después de la inyección. inyección, y desaparecería totalmente a las 48 h post-inyección. Además, se observaron fuertes señales de fluorescencia en las muestras de orina recolectadas de ratones sanos después de 24 h después de la inyección de GP-Si-BP (Fig. 27b complementaria). Estos resultados sugirieron que las sondas construidas podrían eliminarse del cuerpo.

Aquí, desarrollamos una estrategia de caballo de Troya para administrar de manera selectiva y sólida luciferasa y luciferina en varias bacterias naturales, visualizando la distribución bacteriana in vivo con bioluminiscencia. La bioluminiscencia, como modalidad prometedora de imágenes de autoluminiscencia no invasiva, se refiere a la emisión de fotones de la oxidación exotérmica de la luciferina correspondiente catalizada por luciferasa18,19,20,21,22,23,24,25. A pesar de las grandes perspectivas de la bioluminiscencia, apenas ha permitido la obtención de imágenes de bacterias comensales y patógenas debido a las siguientes limitaciones: (1) la bioluminiscencia endógena solo fue producida por algunas bacterias diseñadas específicamente y no era aplicable a la mayoría de las bacterias naturales; (2) la producción de bioluminiscencia exógena requirió la participación de ATP bacteriano, que se obtuvo por lisis bacteriana29,30,31,32,33,34. Una forma más fácil de visualizar varias bacterias naturales in vivo con bioluminiscencia puede ser la entrega selectiva de un reportero bioluminiscente en las células bacterianas, consumiendo directamente el ATP dentro de las bacterias, pero presenta desafíos técnicos debido a la carga electrostática o las barreras de tamaño impuestas por la membrana plasmática bacteriana única. y pared celular. Curiosamente, las estrategias antibióticas del caballo de Troya desarrolladas en la década de 1980 podrían administrar antibióticos conjugados con sideróforos en el citoplasma bacteriano a través de las bacterias importadoras de hierro35,36,37,38,39,40,41. Inspirándonos en esto, propusimos la estrategia BLI del caballo de Troya.

A diferencia de las estrategias antibióticas del caballo de Troya, en nuestro diseño, los indicadores bioluminiscentes se cargaron en SiNP modificados con GP y se transportaron a las bacterias a través de transportadores de azúcar ABC. Es de destacar que las SiNP, como vectores, se han empleado ampliamente en diversas bioaplicaciones debido a su baja o nula toxicidad58,59,60,61,62,63,64. Como se informó anteriormente, las SiNP podrían biodegradarse y eliminarse renalmente sin una toxicidad distintiva in vivo65,66. Por ejemplo, las evaluaciones de toxicidad en Caenorhabditis elegans, gusanos de seda e incluso en modelos animales de primates no humanos (p. ej., macacos cynomolgus) han demostrado que las SiNP internalizadas no afectarían la morfología, la fisiología o las funciones inmunitarias innatas de los animales, lo que sugiere una biocompatibilidad benigna de SiNPs en organismos vivos67,68,69. Sobre esta base, los SiNP de tamaño pequeño han recibido la aprobación de un nuevo fármaco en investigación aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) para el primer ensayo clínico en humanos en enero de 2011 (es decir, NCT01266096, NCT02106598)70,71. Como tal, seleccionamos los SiNP como los vehículos para entregar indicadores bioluminiscentes. Los indicadores bioluminiscentes incluyeron luciferasa y dos colorantes orgánicos, Cy5 e ICG. Como resultado, la emisión NIR se puede lograr mediante un proceso de relé de transferencia de energía de resonancia dual que combina BRET entre luciferasa y Cy5, y FRET entre Cy5 e ICG. Por lo tanto, la estrategia desarrollada tiene el potencial de obtener imágenes de bacterias en tejidos profundos en entornos clínicos específicos. No obstante, la combinación de luciferasa, Cy5 e ICG requiere trabajos relativamente complicados para la preparación de muestras y el análisis cuantitativo, y esto reduce significativamente el impacto de este trabajo. En el siguiente estudio, probaríamos un sistema más simple.

Por otro lado, la investigación pionera en las últimas tres décadas ha aclarado los mecanismos por los cuales la fuente única de carbono de las células bacterianas como las maltodextrinas, la amilosa y el almidón, así como las ciclodextrinas unidas (1-4)-glucosídicamente podrían internalizarse selectivamente. en células bacterianas a través del transportador de azúcar ABC específico de bacterias46,47,48,49,50,51,52,53. Sin embargo, estos conocimientos no han producido estrategias basadas en el transportador ABC exitosas para entregar carga bioluminiscente en células bacterianas. Para llenar este vacío, aprovechamos los transportadores de azúcar ABC específicos de bacterias para internalizar selectivamente la luciferasa y la luciferina al hacer autostop en moléculas GP con dextrosa equivalente de 4.0~7.0. Las sondas Trojan BLI sintetizadas se internalizaron selectivamente en bacterias Gram positivas (p. ej., S. aureus, MRSA de origen clínico) y bacterias Gram negativas (p. ej., STm, E. coli MDR de origen clínico) con una alta tasa de absorción. al 50%. Mostramos su capacidad en imágenes ex vivo de endoftalmitis bacteriana en humanos. Mostramos su imagen selectiva frente a la nefritis y colitis bacterianas en ratones frente a otros tipos de nefritis y colitis en ratones. Además, demostramos que la estrategia desarrollada permitió la eliminación fototérmica de casi el 95 % de las bacterias resistentes a los antibióticos in vitro e in vivo. Anticipamos que la estrategia Trojan BLI propuesta podría catalizar la entrega de diversas sustancias en las células bacterianas, lo que permitiría el desarrollo de diversos enfoques terapéuticos o de imágenes, y las imágenes de bioluminiscencia de bacterias informadas en este trabajo sirven como una prueba inicial del principio.

El protocolo de investigación con muestras de sangre humana fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Soochow. Las muestras se proporcionaron previo consentimiento informado por escrito. Los autores declaran que todos los experimentos con sangre humana se realizaron en estricta conformidad con las leyes y directrices institucionales pertinentes. Las muestras clínicas fueron proporcionadas por el Eye Bank of the Eye, Ear, Nose and Throat Hospital, Fudan University con la aprobación del comité de ética del hospital (EENTIRB-2017-06-07-01). Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con la Declaración de Helsinki y de acuerdo con la ley china.

Tras una irradiación de 7 días y 365 nm a temperatura ambiente sobre la mezcla de C6H17NO3Si y 1,8-naftalimida, se prepararon los SiNP fluorescentes de tamaño pequeño. A continuación, la solución resultante se purificó mediante centrifugación a 3381 x g durante 15 min y diálisis (MWCO, 1000, Spectra/Pro) para eliminar los reactivos que no reaccionaron. Los productos finales de SiNP se recolectaron por evaporación y se almacenaron a 4 oC para los siguientes experimentos. Para obtener SiNP modificados con GP (GP-SiNP), la mezcla de solución de SiNP (200 μL, 0,08 mM) y solución de GP (100 μL, 0,56 mM) se agitó continuamente a 70 °C durante 6 h, seguido de la adición de 0,01 mg de NaBH4 para reaccionar durante otras 12 h a temperatura ambiente. La solución resultante se purificó mediante dispositivos centrífugos Nanosep (corte de PM, 3 kDa; Millipore) mediante centrifugación a 5283 x g durante 15 min para eliminar las moléculas de GP sin reaccionar. Para cargar más moléculas de Cy5 e ICG, se añadieron solución de Cy5 (2 μL, 0,56 mM) y solución de ICG (12 μL, 0,56 mM) a la solución de GP-SiNP preparada anteriormente y se agitó a temperatura ambiente durante la noche. De manera similar, la solución resultante se purificó mediante dispositivos centrífugos Nanosep (corte de MW, 3 kDa; Millipore) mediante centrifugación a 6010 x g durante 10 min para eliminar las moléculas Cy5 e ICG descargadas. Posteriormente, se añadieron solución de luciferasa que contenía amina (0,1 ml, 0,06 mM), solución de EDC (2 μl, 10 mM) y solución de NHS (10 μl, 17 mM) a la solución preparada anteriormente para la reacción durante la noche a temperatura ambiente para obtener GP-Si-BP. Además, la solución resultante se purificó mediante dispositivos centrífugos Nanosep (corte de MW, 100 kDa; Millipore) mediante centrifugación a 5283 x g durante 15 min. Análogamente, también se sintetizó GP-Si-Luc mediante la adición de D-luciferina (0,1 ml, 0,30 mM), solución de EDC (2 μL, 10 mM) y solución de NHS (10 μL, 17 mM) a la solución de GP-SiNPs durante noche a temperatura ambiente seguido del mismo protocolo purificado.

La morfología y el tamaño de las sondas Trojan BLI se caracterizaron mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM, Philips CM 200) con 200 kV. Los espectros de absorción UV-vis de las sondas Trojan BLI se registraron usando un espectrofotómetro de infrarrojo cercano 750 UV-vis (Perkin-Elmer lambda). Los espectros de fotoluminiscencia de las sondas Trojan BLI se registraron utilizando un espectrofluorímetro (HORIBA JOBIN YVON FLUORMAX-4). Los espectros de bioluminiscencia de las sondas Trojan BLI se registraron utilizando un espectrómetro de fluorescencia HITACHI F-4700. La dispersión dinámica de la luz (DLS) y los potenciales Zeta de las sondas Trojan BLI se midieron mediante el uso de un analizador de tamaño de partículas nano submicrónicas y de partículas de potencial Zeta Delsa™ (Beckman Coulter, Inc). Las imágenes de fluorescencia de bacterias in vitro se realizaron utilizando un microscopio de barrido láser confocal (CLSM, Leica, TCS-SP5 II). Las imágenes de fluorescencia y bioluminiscencia ex vivo e in vivo se obtuvieron mediante un sistema de imágenes ópticas in vivo (IVIS Lumina III). Las señales luminiscentes de GP-Si-BP en diferentes soluciones se examinaron utilizando un sistema de imágenes IVIS Lumina III. Para ello, se mezcló GP-Si-BPs a 0,06 mM con ATP a diferentes concentraciones en una placa negra de 96 pocillos. Después de mezclar a fondo, la placa se colocó inmediatamente en el sistema de imágenes para adquirir señales luminiscentes. De manera similar, la luminiscencia atenuada de GP-Si-BP se cuantificó después de la incubación con un inhibidor de ATP, DCC, en presencia de GP-Si-Luc.

Se aislaron Staphylococcus aureus resistente a múltiples fármacos (MRSA) y Escherichia coli resistente a múltiples fármacos (MDR E. coli) derivados clínicamente de pacientes con queratitis y fueron suministrados por el Banco de Ojos del Hospital de Ojos, Oídos, Nariz y Garganta, Universidad de Fudan, bajo la aprobación del comité de ética del hospital (EENTIRB-2017-06-07-01). Escherichia coli (ATCC 11303) y Staphylococcus aureus se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC). Micrococcus luteus (BNCC 102589), Pseudomonas aeruginosa (BNCC 125486) y Salmonella typhimurium (BNCC 108207) se adquirieron de BeNa Culture Collection (BNCC, Shanghai, China). El medio LB se adquirió de Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. Para cultivar las bacterias, primero disolvimos el polvo liofilizado de las cepas en el medio líquido LB, luego recubrimos el líquido bacteriano en el medio de la placa LB y las cultivamos en el incubadora a 37 oC por 12 h. Después de eso, tomamos una sola colonia de la placa y la cultivamos en el medio líquido LB en la incubadora a 250 rpm y 37 oC. Recolectamos las células bacterianas en la fase de crecimiento exponencial. La concentración de bacterias se detectó midiendo la densidad óptica (DO) a 600 nm. El número de colonias bacterianas se contó mediante un instrumento de recuento de colonias (Czone 8). Los experimentos se realizaron de acuerdo con la Declaración de Helsinki y de conformidad con la ley china.

Los 20 µL de suspensión bacteriana purificada y resuspendida (1,0 × 107 CFU) se incubaron con GP-Si-BP (0,06 mM, 200 µL), GP-Si-Luc (0,06 mM, 200 µL), GP-Si- BPs (0,06 mM, 200 µL) + GP-Si-Luc (0,06 mM, 200 µL), Si-BPs (0,06 mM, 200 µL), Si-Luc (0,06 mM, 200 µL) y Si-BPs (0,06 mM , 200 µL) + Si-Luc (0,06 mM, 200 µL) durante 2,5 h en una incubadora con agitación (250 rpm) a 37 oC. Las bacterias se recogieron centrifugando la mezcla a 3381 x g durante 5 min en tubos Eppendorf (EP). Las bacterias resultantes se resuspendieron y se lavaron con PBS tres veces. Luego se transfirieron 10 µL de la solución de bacterias lavadas a un portaobjetos de microscopio cubierto con un cubreobjetos y luego se tomaron imágenes con un microscopio de barrido láser confocal (CLSM, Leica, TCSSP5 II) con un 30 % de potencia de láser de diodo. Todas las imágenes de fluorescencia fueron capturadas por CLSM con un objetivo de inmersión en aceite × 64 y tomadas en las mismas condiciones ópticas, y el microscopio aplicó automáticamente el mismo brillo y contraste a las imágenes. El procesamiento y análisis de ROI se realizó mediante el software comercial de análisis de imágenes (Leica Application Suite Advanced Fluorescence Lite). Además, la aparición de GP-Si-BP en las células bacterianas se confirmó mediante TEM (Philips CM 200).

Todos los procedimientos experimentales con animales se realizaron de acuerdo con el protocolo aprobado por el comité de cuidado de animales de la Universidad de Soochow. Las condiciones de alojamiento de los ratones fueron 25 °C y 65% ​​de humedad ajustada por el equipo de ventilación y sistema de filtración de aire. Para construir colitis inducida por STm en ratones, se trataron ratones desnudos hembra (grado SPF, de 6 a 8 semanas de edad) con 100 μL de solución de estreptomicina (200 mg mL−1) antes de la administración oral de STm. El segundo día después de la infección, a los ratones se les inyectaron por vía intravenosa GP-Si-BP o Si-BP (0,06 mM, 200 µL). A las 6 h después de la inyección de las sondas, los ratones tratados se inyectaron por vía intraperitoneal con GP-Si-Luc o Si-Luc (0,06 mM, 200 µL), seguido de BLI mediante el uso de un sistema de imágenes ópticas in vivo (IVIS Lumina III, exposición tiempo = 5 min, f/stop = 1, binning = 8, FOV = 21,8 cm) a los 15 min después de la inyección de sustratos. A modo de comparación, a los ratones infectados se les inyectó intraperitonealmente luminol (282 mM, 200 μL), seguido de BLI usando un sistema de imágenes ópticas in vivo (IVIS Lumina III, tiempo de exposición = 5 min, f/stop = 1, binning = 8, FOV = 21,8 cm) a los 10 min después de la inyección. Utilizamos la recolección, homogeneización y cultivo de tejido intestinal con recuento de UFC para determinar la cantidad real de bacterias en los sitios de infección durante la obtención de imágenes. La concentración real de STm en el sitio de infección durante la obtención de imágenes fue ~1,0 × 109 CFU. Para probar la selectividad de la estrategia propuesta, construimos colitis inducida por DSS en ratones (hembra, 6–8 semanas de edad, n = 3). Los ratones portadores de colitis DSS se trataron con GP-Si-BPs + GP-Si-Luc (0,06 mM, 200 μL) o luminol (282 mM, 200 μL) para obtener imágenes de luminiscencia (IVIS Lumina III, tiempo de exposición = 5 min, f/stop = 1, binning = 8, FOV = 21,8 cm) de la misma manera que los ratones portadores de colitis STm mencionados anteriormente. Para construir nefritis inducida por S. aureus en ratones, se inyectaron in situ 25 μL de S. aureus en el riñón de los ratones desnudos (hembra, 6 a 8 semanas de edad, n = 3). A las 12 h después de la inyección, a los ratones infectados se les inyectaron por vía intravenosa 200 μl de GP-Si-BP o Si-BP 0,06 mM. Seis horas más tarde, a estos ratones se les inyectó por vía intraperitoneal GP-Si-Luc o Si-Luc (0,06 mM, 200 μL), seguido de imágenes in vivo utilizando un sistema de imágenes ópticas (IVIS Lumina III, tiempo de exposición = 5 min, f /stop = 1, binning = 8, FOV = 21,8 cm) a los 15 min después de la inyección. La concentración real de S. aureus en el sitio de infección durante la obtención de imágenes fue ~1,0 × 108 CFU, que se determinó mediante la recolección, homogeneización y cultivo de tejido renal con recuento de CFU como se mencionó anteriormente. Además, para probar la selectividad de la estrategia propuesta contra la nefritis bacteriana sobre otras nefritis, construimos nefritis causada por glicerina en ratones (hembra, 6–8 semanas de edad, n = 3). Los ratones con nefritis por glicerina se trataron con GP-Si-BPs + GP-Si-Luc (0,06 mM, 200 μL) o luminol (282 mM, 200 μL) para obtener imágenes de luminiscencia (IVIS Lumina III, tiempo de exposición = 5 min, f/stop = 1, binning = 8, FOV = 21,8 cm) de la misma manera que los ratones portadores de nefritis DSS mencionados anteriormente.

S. aureus o E. coli se incubaron respectivamente con PBS o GP-Si-BP, seguido de la irradiación con láser de 808 nm (láser de 808 nm: 1,0 W cm−2, 5 min). La morfología de las bacterias después del tratamiento se caracterizó mediante SEM (FEI Quanta 200 F). S. aureus, E. coli, M. luteus, P. aeruginosa, MRSA y MDR E. coli se trataron respectivamente con PBS, SiNP, Si-BP y GP-Si-BP, seguido de la irradiación con láser de 808 nm (808 -nm láser, 1,0 W cm−2, 5 min). La tasa antibacteriana in vitro se obtuvo en base a las colonias de bacterias en las placas de agar. La tasa antibacteriana se calculó de acuerdo con la ecuación. (1):

donde "Ncontrol" y "Nexperiment" representan recuentos bacterianos (UFC mL−1) en los grupos de control de "PBS" y otros grupos experimentales (experimento), respectivamente.

Utilizamos la nefritis inducida por S. aureus en ratones para evaluar la capacidad antibacteriana de la estrategia desarrollada in vivo. Para construir el modelo, se inyectó in situ S. aureus (25 μL, ~1,1 × 106 CFU) en el riñón izquierdo de los ratones (hembra, de 6 a 8 semanas de edad, n = 3). A las 6 h después de la inyección, a estos ratones se les inyectaron por vía intravenosa 200 μl de GP-Si-BP 0,06 mM o tampón PBS el día 1, el día 3, el día 5 y el día 7, respectivamente. Seis horas después de cada inyección de fármaco, los sitios infectados se irradiaron con o sin láser de 808 nm (1,0 W cm−2, 5 min). Después de la terapia fototérmica, se extrajeron los riñones infectados, seguido de homogeneización y cultivo de los homogeneizados en placas. La tasa antibacteriana correspondiente se calculó en base a la ecuación. (1). Mientras tanto, los tejidos renales infectados después de los tratamientos se fijaron en la solución de PFA al 4 % para la siguiente tinción con H&E.

Células T 293 de riñón embrionario humano (células HEK-293T), células cervicales humanas (células HeLa), células de cáncer de mama humano (células MCF-7) y células endoteliales de retina de ratón (células mREC), cultivadas en medio Eagle modificado de Dulbecco con alta glucosa (H-DMEM), se adquirieron de Shanghai Zhong Qiao Xin Zhou Biotechnology Co., Ltd (China). Todos los medios mencionados anteriormente se complementaron con suero fetal bovino (FBS) inactivado por calor al 10% y antibióticos relevantes al 1% (100 μg mL-1 de estreptomicina y 100 U mL-1 de penicilina). Todas las líneas celulares se cultivaron a 37 °C en una incubadora de CO2 al 5 % con atmósfera humidificada.

Las muestras de sangre humana fueron proporcionadas por un voluntario sano siguiendo el consentimiento informado por escrito. Los protocolos de estudio que utilizan muestras de sangre humana fueron aprobados por el comité de ética de la Universidad de Soochow. Los autores afirman que todos los experimentos con sangre humana se realizaron en estricta conformidad con las leyes y directrices institucionales pertinentes. Diez pacientes con endoftalmitis bacteriana que se sometieron a cirugía vítrea, muestras de líquido vítreo no diluido no contaminado (0,1 ml) se recogieron en una jeringa con una aguja de 30 G durante la vitrectomía diagnóstica pars plana (VPP). Inmediatamente después de la recolección, la muestra se transfirió a un tubo de microcentrífuga preesterilizado y se usó para obtener imágenes. Estas muestras clínicas también fueron suministradas por el Eye Bank of the Eye, Ear, Nose and Throat Hospital, Fudan University, bajo la aprobación del comité de ética del hospital (EENTIRB-2017-06-07-01).

Para la prueba de significación estadística, utilizamos un análisis ANOVA de una vía o la prueba t de dos colas pareadas. El análisis estadístico se realizó utilizando el software de Origin o GraphPad Prism. Las barras de error representan la desviación estándar obtenida de tres mediciones independientes. Se empleó la región de interés (ROI) para las evaluaciones cuantitativas de la intensidad de la fluorescencia, que se calculó mediante el software comercial de análisis de imágenes (Leica Application Suite Advanced Fluorescence Lite 2. 6. 0, LAS AF Lite 2. 6. 0).

Los tamaños de los grupos para los experimentos se eligieron sobre la base de la experiencia previa y la literatura previa, de modo que se usaron números suficientes para garantizar la reproducibilidad y determinar las desviaciones estándar. El número de animales fue de al menos 3. Para cada muestra se realizaron dos repeticiones técnicas. Si hubo una variación del 20 % o más entre las réplicas técnicas, se llevaron a cabo dos réplicas técnicas adicionales. Todos los experimentos se llevaron a cabo con al menos 3 muestras repetidas para cada grupo experimental y confirmamos que todos los intentos de replicación fueron exitosos. No se excluyeron datos de los análisis. Las muestras se distribuyeron en grupos experimentales al azar. Toda la recopilación y el análisis de datos fueron ciegos con muestras aleatorias.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el documento y su información complementaria. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Agradecemos al Prof. Shuit-Tong Lee (Universidad de Soochow, China), al Prof. Chunhai Fan (Universidad de Shanghai Jiao Tong, China) y al Dr. Fei Peng (Universidad de Harvard, EE. UU.) por su ayuda general y sus valiosas sugerencias. YH divulga el apoyo a la investigación descrita en este estudio de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China [número de subvención 21825402], Programa para Profesores Especialmente Designados de Jiangsu para el Profesor Yao He, un proyecto financiado por el Desarrollo del Programa Académico Prioritario de las Instituciones de Educación Superior de Jiangsu (PAPD ), 111 Proyecto y Centro de Innovación Colaborativa de Suzhou Nano Ciencia y Tecnología (NANO-CIC). HYW divulga el apoyo para la investigación descrita en este estudio de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China [número de subvención 22074101] y la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Jiangsu de China [número de subvención BK20191417]. JXH divulga el apoyo a la investigación descrita en este estudio de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China [número de subvención 81970766, 82171102], el Programa de Desarrollo de Innovación de Shanghái [número de subvención 2020-RGZN-02033] y el Programa de Investigación Clínica Clave de Shanghái [número de subvención SHDC2020CR3052B ]. BS divulga el apoyo a la investigación descrita en este estudio de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China [número de subvención 22204116] y la Fundación de Ciencias Naturales de la provincia de Jiangsu de China [número de subvención BK20200851]. La BBC divulga el apoyo a la investigación descrita en este estudio de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China [número de subvención 22204117] y la Fundación de Ciencias Postdoctorales de China [número de subvención 2021M692347].

Estos autores contribuyeron por igual: Qian Zhang, Bin Song, Yanan Xu.

Suzhou Key Laboratory of Nanotechnology and Biomedicine, Institute of Functional Nano & Soft Materials & Collaborative Innovation Center of Suzhou Nano Science and Technology (NANO-CIC), Universidad de Soochow, Suzhou, 215123, China

Qian Zhang, Bin Song, Yanan Xu, Yunmin Yang, Jianping Lu, Jiali Ding, Haiting Cao, Binbin Chu, Houyu Wang y Yao He

Departamento de Oftalmología y Ciencias de la Visión, Hospital de Ojos, Oídos, Nariz y Garganta de Shanghái, Universidad de Fudan, Shanghái, China

Jian Ji, Wenjun Cao y Jiaxu Hong

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QZ, BS, JXH, YNX, YMY, HYW y YH concibieron y diseñaron la investigación. QZ y BS llevaron a cabo la mayoría de los experimentos y analizaron los datos. YMY, JJ, WJC, JPL, JLD, HTC y BBC realizaron experimentos y caracterizaciones adicionales. QZ, YNX, JXH, HYW y YH escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Jiaxu Hong, Houyu Wang o Yao He.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de revisión por pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Zhang, Q., Song, B., Xu, Y. et al. Imágenes de bioluminiscencia in vivo de bacterias naturales dentro de los tejidos profundos a través del transportador de azúcar de casete de unión a ATP. Nat Comun 14, 2331 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37827-9

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Recibido: 27 de octubre de 2022

Aceptado: 03 abril 2023

Publicado: 22 abril 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37827-9

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