Viendo la vida sin etiquetas bajo microscopios ópticos

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 559 (2023) Citar este artículo

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Los microscopios ópticos de hoy han superado los límites de velocidad, calidad y espacio observable en muestras biológicas, revolucionando la forma en que vemos la vida hoy. Además, el etiquetado específico de muestras para imágenes ha proporcionado información sobre cómo funciona la vida. Esto permitió que la microscopía basada en etiquetas se filtrara e integrara en la investigación general de ciencias de la vida. Sin embargo, el uso de la microscopía sin etiquetas se ha limitado en su mayoría, lo que ha dado lugar a pruebas de bioaplicación pero no de biointegración. Para permitir la biointegración, estos microscopios deben evaluarse en cuanto a su oportunidad para responder preguntas biológicas de manera única y establecer una perspectiva de crecimiento a largo plazo. El artículo presenta microscopios ópticos sin etiquetas clave y analiza su potencial integrador en la investigación de ciencias de la vida para el análisis imperturbable de muestras biológicas.

Históricamente, la microscopía óptica ha avanzado paralelamente a las ciencias de la vida. Hoy en día, cualquier instalación de investigación biológica estándar está equipada con un microscopio para obtener imágenes de morfologías en modo de campo claro y distribuciones moleculares en modo de epifluorescencia para observar estructuras de interés marcadas. Esta configuración es ideal para un biólogo, ya que la mayoría de los estudios se pueden realizar con un sistema de este tipo o se pueden diseñar para que se acomoden en ellos. La necesidad de cuantificación molecular y cortes ópticos precisos hizo que la microscopía confocal de barrido láser fuera una de las favoritas entre los biólogos. El creciente interés en obtener imágenes rápidas y en vivo de muestras gruesas en 3D ha servido como retroalimentación oportuna para desarrollar herramientas de imágenes como microscopios multifotónicos1,2,3,4,5,6 y de lámina de luz7,8,9. La necesidad de observar los cambios dinámicos celulares fomentó los métodos basados ​​en fluorescencia como la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET)10, 11, la microscopía de imágenes de por vida de fluorescencia (FLIM)12,13 y la recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo (FRAP)14,15. La importancia de observar detalles minuciosos motivó métodos de superresolución como la iluminación estructurada (SIM)16,17, el agotamiento de emisión estimulada (STED)18,19 y la microscopía de localización de una sola molécula (SMLM)20,21,22. Los sistemas de apoyo como cámaras más rápidas, automatización adaptativa de alto rendimiento y tintes innovadores han ampliado aún más las bioaplicaciones. Aún así, existe una brecha donde los métodos basados ​​en etiquetas son limitados, es decir, en la evaluación químicamente imperturbable de muestras biológicas, sin ninguna intervención de etiquetas y productos químicos asociados.

Muchos métodos de obtención de imágenes sin etiquetas bien conocidos, a pesar de sus ventajas, están limitados cuando el objetivo son los estudios mecánicos o el descubrimiento de conocimientos. Por ejemplo, la microscopía de campo claro, contraste de fase y contraste de interferencia diferencial (DIC) son opciones comunes de los biólogos. La microscopía de campo claro es más adecuada cuando las muestras se tiñen con un tinte que confiere el contraste. Sin embargo, para estudios en vivo, obtener imágenes de alto contraste para células vivas casi transparentes es un desafío. Las imágenes de contraste de fase y DIC aumentan ópticamente la diferencia entre la muestra y el fondo para generar una imagen de alto contraste y se utilizan habitualmente con microscopía de fluorescencia. Tanto el contraste de fase como las imágenes DIC son herramientas muy útiles para un biólogo. Pero no pueden cuantificar los cambios de fase, ya que los valores de intensidad no están relacionados linealmente con la información de fase y, por lo tanto, no se pueden rastrear hasta los cambios reales en la muestra.

Hoy en día, el avance en la obtención de imágenes sin etiquetas ha permitido obtener imágenes de alta resolución y alta velocidad de la morfología, la dinámica, la funcionalidad, el intercambio de materiales, la interacción con patógenos, la bioquímica y la biomecánica (Fig. 1). Este artículo analiza la amplia selección de diferentes microscopios ópticos sin etiquetas, sus aplicaciones biológicas y su potencial para convertirse en una poderosa herramienta de la investigación biomédica convencional. Este artículo, por lo tanto, tiene como objetivo establecer las bases para elegir herramientas de microscopía óptica sin etiquetas adecuadas para aumentar los métodos establecidos y, finalmente, desempeñar un papel más integrador en el descubrimiento de conocimientos.

La figura ilustra la aplicabilidad de los microscopios ópticos sin etiquetas disponibles para evaluar los atributos estructurales, biomecánicos y bioquímicos de las células y tejidos como una medida de sus funciones. Imagen de fase cuantitativa QPM, microscopía de autofluorescencia AF, microscopía de segunda generación armónica SHG, microespectroscopía FTIR FTIR, microespectroscopía Raman Raman, microscopía BM Brillouin, elastografía de coherencia óptica OCE, tomografía de coherencia óptica OCT, D-OCT Doppler-OCT, microscopía fotoacústica PAM.

La necesidad de cuantificar imágenes de fase sin etiquetas motivó métodos de obtención de imágenes de fase cuantitativos que en su mayor parte han permanecido sin explotar en la investigación de las ciencias de la vida. La microscopía de fase cuantitativa (QPM) está destinada a medir los retrasos de la ruta óptica (o cambios de fase) causados ​​por la muestra. Al no tener etiquetas, QPM permite obtener imágenes en vivo sin toxicidad química ni pérdida de señal debido a factores externos, como el fotoblanqueo en la microscopía de fluorescencia. Varios métodos QPM actuales se basan en la teoría inicial de formación de imágenes de Ernst Abbe en 187323, que estableció una imagen como un interferograma complicado formado por la superposición de ondas de luz que atraviesan la muestra.

QPM necesita ser evaluado para la fidelidad de la información y el valor del conocimiento biológico para resistir la prueba del tiempo. El aspecto más importante de un QPM es el manejo del ruido para establecer su cuantificabilidad. Esto se rige por la sensibilidad de fase espacial y temporal del sistema. La mitigación del ruido se logra de muchas maneras, incluido el uso de difusores, iluminación de luz blanca y fuentes de luz de baja coherencia temporal que mejoran la calidad de la imagen. Para reducir el ruido debido a las acciones de escaneo, surgieron QPM de campo completo, que son técnicas que no son de escaneo. Los QPM de campo completo utilizan la interferencia de la luz de los dos planos (muestra y referencia) para proporcionar información sobre los retrasos del camino óptico introducidos por la muestra. Las geometrías interferométricas determinan si el sistema tendrá una alta resolución espacial como en el QPM de cambio de fase o una alta resolución temporal de un QPM24 fuera del eje. Además, los QPM sin interferometría, como el método de transporte de intensidad, obtienen información de fase sin geometría interferométrica especializada, sino solo dos imágenes de intensidad, una enfocada y otra ligeramente desenfocada25. Aunque el método es fácil de implementar sin necesidad de sistemas muy especializados, está diseñado para imágenes de baja resolución. Tecnologías como la microscopía de fase de Fourier (FPM)26, la microscopía holográfica digital (DHM)27, la microscopía de fase de difracción (DPM)28, la tomografía de difracción óptica (ODT)29, la microscopía de interferencia de luz espacial (SLIM)30, la interferometría digital de campo amplio ( WFDI)31 son algunas de las tecnologías QPM destacadas que han surgido a lo largo de los años. El enfoque de QPM hoy está cambiando del desarrollo tecnológico a las aplicaciones prácticas. Hoy en día, las tecnologías QPM han demostrado aplicación en biología del desarrollo32, neurociencia33,34,35, microbiología36, patología37, cáncer38, enfermedades genéticas31, inmunología39, farmacología39, curación de heridas36 y trastornos metabólicos40. Sin embargo, la aplicabilidad de un método a cualquier campo biológico debe parametrizarse para garantizar el atractivo universal del método.

En términos generales, QPM mide la información de morfología, dinamismo y volumen en las células. Las características morfológicas se pueden medir para determinar el crecimiento, la viabilidad, la respuesta a estímulos externos o la patología utilizando valores de cambio de fase. Pero el valor de fase cuantificado se combina con la altura y el índice de refracción. Por lo tanto, si es crucial determinar cualquiera de los dos, es necesario desacoplarlos correctamente. El desacoplamiento es realmente relevante ya que puede permitir medir parámetros adicionales como el volumen y la masa celular. Un método de desacoplamiento incluye el uso secuencial de dos medios de índice de refracción diferentes y la medición de los retrasos de fase41. Otras formas incluyen el uso de múltiples ángulos de iluminación que dan como resultado imágenes tomográficas y el uso de longitudes de onda duales en medios altamente dispersivos. La combinación de QPM con un chip canalizado (canales mili/microfluídicos) puede medir la osmolaridad intracelular, los cambios de volumen celular, la concentración macromolecular, la respuesta a estímulos de choque y el flujo temporal del transporte molecular en las células41. Además, los datos de QPM resueltos en el tiempo se han utilizado para medir la difusión de partículas mediante espectroscopia de fase de relación de dispersión (DPS)42. La técnica se basa en la fluctuación de la intensidad debido a las señales dispersas de la muestra en un ángulo fijo para determinar el caudal de partículas y predecir las características del transporte (activo/pasivo).

La fase también se utiliza de manera innovadora para obtener imágenes de la adhesión celular en superficies de vidrio y sirve como un análogo sin etiquetas de microscopía de reflexión interna total (TIRF) mediante un método llamado microscopía de reflexión de interferencia (IRM)43, 44. El método produce contraste de imagen basado en la diferencia de fase. entre la luz reflejada por el vidrio y la región celular muy cercana al vidrio. Por lo tanto, la superficie de la celda unida más cerca del vidrio aparece más oscura debido a la interferencia destructiva entre la superficie de la muestra y las luces reflejadas en el vidrio. Aunque el método se utiliza para obtener imágenes de microtúbulos y superficies celulares con alto contraste45, se limita en gran medida a una región muy delgada. También se ha demostrado que combinar IRM con microscopía de fluorescencia es funcionalmente relevante en estudios dinámicos que involucran células inmunitarias46. Esto se logra mediante el seguimiento de los puntos de contacto de las células T en un cubreobjetos inmunológicamente activo, lo que da como resultado la visualización de los puntos de contacto celular de forma correlativa con los niveles de calcio visibles con fluorescencia.

Las mediciones de fase por los métodos de imagen discutidos hasta ahora están destinadas a muestras delgadas o regiones cercanas a la cubierta de vidrio. Esto se debe a que tienen un rango limitado del campo de imagen o están abrumados por fuertes señales de dispersión que se originan en los sitios desenfocados de la muestra.

La obtención de imágenes más profundas en tejidos, órganos y animales es un desafío general de la microscopía óptica. Dado que el entorno 3D es crucial para las funciones biológicas, es importante visualizar la vida en 3D. Las etapas embrionarias tempranas y los animales pequeños como C. elegans, Drosophila y las larvas de pez cebra ahora son bastante susceptibles a la microscopía ya que no son demasiado densos ópticamente. La necesidad incipiente de obtener imágenes de procesos humanos o de mamíferos en escalas de longitud más pequeñas generó un interés masivo en cultivos 3D, esferoides, tejidos modificados y organoides que pueden desafiar fácilmente los métodos ópticos disponibles. Si la resolución puede verse comprometida, se puede acceder a regiones más profundas de la muestra utilizando longitudes de onda de luz más largas. Una técnica tomográfica basada en interferometría que precede a los QPM es la tomografía de coherencia óptica (OCT) que demuestra una resolución espacial de 5 a 15 μm para obtener imágenes hasta profundidades de 3 a 5 mm. Esto ha ayudado a la integración clínica de OCT47 en oftalmología, dermatología, investigación del cáncer, odontología, gastroenterología y cardiología. Las modificaciones de la OCT como la OCT sensible a la polarización48, la OCT-angiografía49, la OCT-doppler50 y la OCT-elastografía51 han permitido obtener imágenes funcionales de la matriz extracelular, el flujo sanguíneo y la rigidez del tejido. Sin embargo, la OCT, al igual que otros métodos sin etiquetas, adolece de ruido y artefactos. Mediante el uso de componentes ópticos estabilizadores para filtrar la luz muy dispersa y la obtención de imágenes más rápidas con el dominio de Fourier, la sensibilidad de la OCT ha aumentado. Sin embargo, la cuantificación, especialmente de las regiones de tejido profundo, se ve afectada por la atenuación de la luz. Para resolver esto, los métodos de corrección de atenuación son fundamentales para aumentar la cuantificabilidad de las imágenes de OCT para determinar la progresión del cáncer52 y la cicatrización de heridas53. Aunque la OCT llega a lo más profundo de las muestras, no puede realizar escalas submicrónicas donde acecha un tesoro oculto de cuestiones biológicas.

Equilibrar la profundidad y la resolución es un aspecto clave de cualquier imagen 3D sin etiquetas de muestras gruesas. Durante mucho tiempo, QPM no prosperó en la obtención de imágenes de muestras gruesas debido al manejo deficiente de múltiples luces dispersas que borraban los detalles y daban como resultado una calidad de imagen deficiente. Sin embargo, con la microscopía de interferencia de luz de gradiente (GLIM)32,54, la cuantificación de fase se puede lograr para varios cientos de micrones en la muestra con la capacidad de crear tomogramas que permiten la visualización de la sección transversal. GLIM eclipsa a todos sus predecesores en la medición de la viabilidad embrionaria, estudios fisiológicos de cultivos 3D, tejidos diseñados, organoides y organismos vivos (como C. elegans y pez cebra). GLIM es el análogo sin etiquetas de la microscopía confocal en términos de su capacidad para seccionar ópticamente la muestra mediante la supresión de las señales dispersas fuera de foco. Por lo tanto, la resolución GLIM está restringida solo por el límite de difracción óptica.

Las muestras biológicas no solo pueden cambiar la fase de la luz sino también la polarización. Por lo tanto, la microscopía de luz de polarización (PLM) se ha convertido en un buen complemento para la microscopía de fase. PLM se utiliza para obtener imágenes de estructuras ópticamente anisotrópicas como proteínas fibrosas como colágeno55, actina56, microtúbulos57 y husos mitóticos58 que, de otro modo, son difíciles de discernir claramente en microscopía de fase. PLM funciona con luz que pasa a través de dos filtros polarizadores antes y después de la muestra biológica. Idealmente, la luz del primer filtro no puede pasar a través del segundo. Pero la anisotropía en la muestra orienta la luz de una manera que permitirá que pase algo de luz a través del segundo filtro, lo que permite la visualización de estas estructuras anisotrópicas presentes en la muestra. Además, la necesidad de cuantificación motivó la aparición del PLM cuantitativo (qPLM) para medir características como el retardo y la orientación59,60. La complementariedad de la microscopía de fase y polarización para medir tanto la densidad como el retardo impulsó la combinación de los dos métodos sin etiquetas61,62,63. Se realiza una variación de alto rendimiento de las imágenes combinatorias de fase y polarización mediante la integración de métodos de aprendizaje computacional para desarrollar imágenes cuantitativas sin etiquetas con fase y polarización (QLIPP)64.

La obtención de imágenes de fase cuantitativa de escalas celulares a subcelulares exige una resolución superior a la que permite el límite de difracción. Esto se puede lograr mediante la extracción innovadora de información sobre el complejo campo disperso que encapsula los detalles más finos de la estructura que se está fotografiando antes de la reconstrucción. Un método consiste en rotar la iluminación o la muestra con respecto a la otra y adquirir, en esencia, múltiples perspectivas de la muestra. Luego, las múltiples imágenes 2D se reconstruyen utilizando algoritmos para obtener un tomograma 3D. Esto mejora la resolución lateral del QPM por un factor de dos o más34,65. 2π-DHM, un método especializado basado en DHM, utiliza iluminaciones de 360°, un láser UV azul de 405 nm y dos objetivos petroleros de alta apertura numérica (NA) para lograr el objetivo34. El objetivo de recolección adquiere la luz que pasa a través de las muestras en diferentes ángulos de 0 a 360° capturando perspectivas más angulares dando como resultado la imagen hasta una resolución espacial de 70 nm.

Otro método de obtención de imágenes de superresolución sin etiquetas de alto contraste es el microscopio de dispersión coherente rotatoria (ROCS)66. ROCS puede obtener imágenes de estructuras pequeñas (150 nm) y rápidas como podios celulares, biofilamentos y nanopartículas similares a virus. Un láser azul de rotación rápida produce una iluminación de 360° en la muestra. La luz dispersada se recoge en cuestión de unos pocos milisegundos, lo que da como resultado una adquisición rápida. La capacidad de obtener imágenes de partículas de 100 nm sin etiquetas rápidamente ha permitido comprender las interacciones virales dinámicas con las células vivas.

En microscopía, junto con la alta resolución espacial, lograr imágenes rápidas simultáneas también es crucial en ciertos estudios biológicos. Por lo tanto, la captura de la interacción virus-huésped en vivo que necesita una resolución espacial en nanómetros y una resolución temporal en microsegundos es una buena opción. Esto se logra con métodos sin etiquetas, como la microscopía coherente de campo claro (COBRI)67 y la microscopía de dispersión interferométrica (iSCAT)68,69,70. COBRI es una modificación del microscopio de campo claro estándar mediante el uso de iluminación de luz láser coherente espacial y temporalmente. Esto se traduce en una resolución espacial de unos pocos nanómetros y una resolución temporal de 10 μs. iSCAT, por otro lado, utiliza la luz dispersada por las nanopartículas, como los virus, con una sensibilidad mejorada mediante interferometría70. Si bien la salida fluorescente está limitada por la molécula de fluoróforo y el fotoblanqueo, en el dominio libre de etiquetas, la salida de fotones de la dispersión de luz se puede aumentar simplemente aumentando la luz incidente (ya que se dispersa un porcentaje fijo de la luz incidente). Con un mayor rendimiento, se necesita menos tiempo para recopilar la misma información, lo que permite obtener imágenes rápidamente. Sin embargo, el simple aumento de la intensidad de los fotones, además de la fototoxicidad, introduce una dispersión de fondo significativa, anulando así el propósito de la detección ultrasensible. Es aquí donde entra en juego la detección de la dispersión interferométrica. En iSCAT, tanto la luz dispersada por las nanopartículas como la luz reflejada por la interfase vidrio/agua se recolectan después de un enfoque preciso con un objetivo NA alto. El método es ideal para partículas más pequeñas (<50 nm) ya que la diferencia entre la luz dispersada y reflejada es significativamente alta para crear el contraste requerido. Además de estos métodos, hoy en día se utilizan cada vez más métodos alternativos sin etiqueta para el seguimiento viral70,71.

Mientras que la microscopía de fase se basa en la luz incidente que es alterada por la muestra, los materiales biológicos están llenos de moléculas que pueden ser detectadas por sensores ópticos. La microscopía fotoacústica (PAM), por ejemplo, detecta pigmentos como la hemoglobina. PAM excita el objetivo con pulsos de láser y la expansión térmica resultante de los pigmentos emite ondas mecánicas detectadas por el detector de ultrasonido. La detección ultrasónica permite que PAM genere imágenes hasta una profundidad de 1 a 3 mm. La resolución lateral está determinada por qué tan bien se enfoca la luz en la muestra y clasifica a la PAM como variaciones resueltas ópticamente (resolución de 0,2 a 1 μm hasta 1 mm) o resueltas acústicamente (resolución de 2 a 15 μm hasta 2 a 3 mm). La resolución lateral de PAM se ha llevado a 90 nm debido a métodos innovadores de superresolución72,73. PAM se utiliza en el estudio de la microvasculatura sanguínea con aplicaciones clínicas en la evaluación de heridas74,75, la formación de nuevos vasos sanguíneos76, las úlceras del pie diabético77 y la angiogénesis78.

Además de los cromóforos, nuestro cuerpo prevalece con moléculas autofluorescentes. La autofluorescencia suele ser una molestia en la obtención de imágenes, ya que interfiere con las moléculas marcadas con fluorescencia. Sin embargo, la autofluorescencia se utiliza para desentrañar procesos fisiopatológicos clave como la transición epitelial-mesenquimatosa79 y la troncalidad del cáncer80. En las imágenes de autofluorescencia celular, las moléculas metabólicas como NADH y FADH reflejan los impuestos sobre la energía celular y es probable que varíen en cuanto a proliferación, crecimiento y diferenciación. Por otro lado, en los tejidos, la matriz extracelular (ECM) tiene colágeno y elastina que indican la integridad mecánica del tejido y se ve afectada durante la remodelación, la fibrosis y el cáncer. Además, la autofluorescencia también se puede aprovechar para la microscopía de superresolución para visualizar nanoestructuras para obtener imágenes de estados de cromatina en células81 y detección histopatológica en tejidos cancerosos82. El inconveniente de la especificidad molecular la ha limitado a fines de clasificación de enfermedades. Se pueden incorporar estrategias que incluyen el uso de filtros ajustados de excitación y emisión, ensayos adicionales, puntos de referencia estructurales y conocimiento de la muestra para permitir la utilidad, la fidelidad y la cuantificabilidad del método.

Las fibrillas de ECM como el colágeno y la elastina son autofluorescentes pero son densas y difíciles de validar. La formación de imágenes de segunda generación armónica (SHG) es otro método sin etiquetas que detecta estructuras de fibrillas en muestras biológicas y puede ser complementario a la autofluorescencia de ECM. Además de ECM, SHG puede obtener imágenes de microtúbulos y complejos de actomiosina intracelulares. Por lo tanto, tiene valor en la evaluación del potencial de enfermedad83. SHG ejemplifica el uso de la modulación de la luz para resaltar información nano/microestructural específica en la muestra, como la forma fibrilar. La ventaja clave de SHG es su uso de la polarización de la luz en lugar de la absorción y, por lo tanto, reduce la fototoxicidad y el fotoblanqueo. Además, como utiliza luz infrarroja cercana, se puede utilizar para obtener imágenes de muestras más gruesas de hasta cientos de micras. Además, las imágenes de SHG son específicas de las estructuras fibrilares y ofrecen una alta sensibilidad estructural. La sensibilidad y especificidad estructural hacen que la SHG se pueda traducir a varias aplicaciones clínicas, como enfermedades del tejido conectivo, fibrosis, afecciones cardíacas y musculoesqueléticas y cánceres83,84,85. Además, se ha logrado una mejora de al menos 2 veces en SHG con varios métodos de súper resolución5,86,87 que permiten la cuantificación precisa de la densidad fibrilar y las descripciones estructurales. Desde un punto de vista técnico, la microscopía de dos fotones ha impulsado gran parte de los desarrollos recientes en autofluorescencia3,88,89,90 e imágenes SHG83,84,85,86,91,92,93,94 usando microscopía no lineal.

La detección de cambios funcionales es vital para comprender los mecanismos biológicos. Los ensayos bioquímicos, las transferencias moleculares y los métodos espectroscópicos son, por lo tanto, herramientas para la caracterización funcional global de la muestra. Dada la gran heterogeneidad espacial en las muestras biológicas, los desarrollos cruciales a menudo se promedian, lo que dificulta la comprensión de una parte faltante de las vías biológicas. Por lo tanto, la necesidad de obtener imágenes funcionales del campo de la muestra impulsó los métodos de tinción química y las evaluaciones microscópicas posteriores han ayudado mucho a los biólogos y patólogos95,96,97. Aunque estos métodos encuentran uso en la puesta en escena de estados funcionales como la muerte, el daño, la organización o la multiplicación, a menudo son difíciles de cuantificar debido a las subjetividades en el procedimiento de tinción. Además, los detalles se limitan a la resolución espacial del microscopio óptico, lo que permite identificar cambios que ya se han manifestado o que se encuentran en una etapa de progresión relativamente avanzada. Algunas marcas de fluorescencia también pueden ofrecer información química a través de la activación de la fluorescencia ligada a la condición98,99, sin embargo, se limitan solo a unas pocas funciones biológicas.

Para comprender el inicio temprano de las enfermedades, es necesario identificar los cambios tempranos del grupo funcional químico (escala de longitud de 100 a 200 pm) que están mucho más allá del poder de los microscopios ópticos convencionales, incluida la superresolución (Fig. 2). Los avances en los métodos de espectroscopia óptica como la espectroscopia infrarroja transformada de Fourier (FTIR)100 y la espectroscopia Raman101 llenan este vacío al proporcionar información sobre los cambios en los enlaces químicos y los grupos funcionales. Un espectro típico contiene varios picos, cada uno correspondiente a una especie química específica. La altura, el ancho y la ubicación/cambios brindan información clave sobre la concentración, diversidad y longitudes de enlace/energías de enlace de las especies químicas. El factor limitante de la resolución espectral también se trata mediante algoritmos de deconvolución espectral que resuelven picos anchos como bandas de amida para revelar subpicos de estructuras secundarias de proteínas102. De esta manera, los métodos de espectroscopia son complementos perfectos de las imágenes y juntos pueden ser útiles para comprender los misterios de la vida en la salud y la enfermedad102. Otro factor limitante más es identificar información química espacialmente coincidente en la muestra heterogénea. Esta necesidad ha sido abordada en gran medida por las versiones de microscopía espectral o microespectroscopía de FTIR103 y Raman104,105,106. Los métodos de microespectroscopia utilizan el mismo principio que su contraparte de espectroscopia con la capacidad añadida de una lente objetivo que escanea espacialmente la muestra. Por lo tanto, tenemos una pila de imágenes con una imagen para cada longitud de onda en el rango espectral del sistema de imágenes. La microespectroscopia, al igual que la contraparte de la espectroscopia, sufre las mismas limitaciones que los equivalentes de la espectroscopia, como la gestión del ruido, la necesidad de ajustes de línea de base, la mitigación de la autofluorescencia (para Raman) y las señales de interferencia que se originan en el sustrato o el contenido de agua. No obstante, con una mejor gestión del ruido y una mayor resolución espectral y espacial, se puede extraer información bioquímica más detallada.

La microscopía óptica y la espectroscopia detectan diferentes escalas de organización y, por lo tanto, son complementarias para visualizar diferentes fases de desarrollo y enfermedad. La microscopía óptica, incluso con la súper resolución, no puede ir más allá de 1 nm. La microespectroscopia detecta los cambios químicos que ocurren a niveles de grupos funcionales con la distribución espacial. Sin embargo, con miles de cambios químicos que ocurren, es difícil usar la espectroscopia sola, especialmente al inicio temprano, hasta que se correlacione con los cambios estructurales manifestados que ocurren en escalas micrométricas a nanométricas. Esto puede ayudar a caracterizar el inicio temprano de la enfermedad, así como a comprender la base de varios eventos fisiológicos y patológicos.

La microscopía y la microespectroscopía se pueden usar correlativamente juiciosamente para predecir cambios muy tempranos en los sistemas biológicos (Fig. 2). Durante mucho tiempo, la resolución de la microespectroscopia no coincidía con los microscopios avanzados. Esto se debe a que el primero todavía recopiló información espectral de un área que abarca varios píxeles. Esto ha cambiado a lo largo de los años cuando la nanoscopía se llevó a la microespectroscopía FTIR107,108,109 y Raman110,111,112,113, lo que permitió una resolución espectral y espacial de alta resolución para la comparación punto a punto con otros métodos de imágenes de alta resolución. Además, el crecimiento de la imagenología espectral de alta velocidad114 y las modificaciones de atrapamiento de una sola molécula115, 116 han mejorado la precisión en la imagenología de células vivas e in vivo117.

Las imágenes ópticas no lineales por microscopios de dos fotones no solo han potenciado la autofluorescencia y las imágenes SHG, sino también métodos de imágenes espectrales como la dispersión Raman anti-stokes coherente (CARS) y la microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS) para obtener imágenes de proteínas, gotas de lípidos y ácidos nucleicos. ácidos118,119. CARS y SRS son imágenes ópticas no lineales y utilizan múltiples etapas de excitación para recopilar información química de una región espectral específica de una especie química. Las regiones de estiramiento C-H y las regiones de huellas dactilares de proteínas son las más utilizadas. El hecho de que estas regiones estén pobladas espectralmente da como resultado la superposición de múltiples especies químicas, lo que interfiere en la identificación de las contribuciones de un grupo funcional particular. Sin embargo, la desconvolución espectral se puede utilizar en ciertos casos para recuperar información pura en muchos casos120,121.

Al igual que los receptores químicos en la superficie celular, también hay mecanorreceptores que pueden traducir las fuerzas biofísicas para permitir la expresión génica y modular las funciones biológicas. La mecanobiología se ha demostrado en células madre122, progresión tumoral123, enfermedades neurodegenerativas106, biología del desarrollo124, biología regenerativa125, adhesión celular y migración126. Muchos estudios biomecánicos en células y tejidos se realizan indirectamente en la actualidad marcando moléculas mecanosensibles y observando sus expresiones y localización en microscopía de fluorescencia. Sin embargo, obtener imágenes directamente de los cambios mecánicos dinámicos de células vivas y tejidos sin etiquetas ayudaría a comprender los cambios dinámicos en la salud y la progresión de la enfermedad.

Las dos modalidades de imágenes mecánicas más populares son la microscopía de fuerza atómica (AFM) y la elastografía por ultrasonido (USE). AFM está diseñado para escalas extremadamente pequeñas (1 nm - pocas micras) de fuerzas físicas que proporcionan información mecánica superficial. UTILICE imágenes a escala de órganos con penetración transcorporal y, por lo tanto, adecuadas para entornos clínicos. Sin embargo, existe una brecha en la escala de longitud entre unas pocas micras y unos pocos milímetros (células y tejidos) que tiene un enorme potencial para la exploración biomecánica.

El análogo óptico de USE es la elastografía de coherencia óptica (OCE), que es un avance funcional de OCT. OCE utiliza una fuente externa de deformación tisular que puede estar basada en contacto o sin contacto para medir los desplazamientos tisulares51,127. OCE puede determinar la rigidez mecánica a profundidades de varios milímetros en muestras no homogéneas, lo que es ideal para tejidos biológicos, modelos 3D in vitro y modelos de animales pequeños. Sin embargo, la limitación sigue siendo la resolución que está en decenas de micras. Esto limita sus aplicaciones donde se justifican las resoluciones celulares o subcelulares.

La microscopía de Brillouin es una imagen mecánica sin etiquetas que proporciona una resolución limitada por difracción basada en los principios de la dispersión de luz de Brillouin128 para medir longitudinalmente129 o el módulo de corte130. La dispersión de Brillouin es un evento de dispersión inelástica que ocurre debido a la interacción de los fotones de la fuente de luz y los fonones (vibraciones mecánicas) de la muestra. Los fonones interactúan con la luz incidente intercambiando energía y dando como resultado una población de luz dispersada inelásticamente (dispersión de Brillouin). Estas dispersiones de Brillouin proporcionan una medida de la propiedad mecánica de la muestra. La microscopía de Brillouin se ha aplicado a células y tejidos hoy en día con alta velocidad y baja fototoxicidad129. En las células, los cambios mecánicos surgen de modificaciones del citoesqueleto, uniones de interacciones célula-célula o célula-matriz, y la fracción de volumen sólido-líquido del citoplasma y las membranas. En la matriz extracelular de los tejidos, la disposición, el entrecruzamiento y la densidad de las proteínas son responsables de las propiedades mecánicas. La microscopía de Brillouin se ha demostrado en varios modelos biológicos y enfermedades. Se ha utilizado en biología celular131, biología del desarrollo132, estimación del potencial metastásico de tumores133, depósito de placa en la enfermedad de Alzheimer104 y rigidez de la MEC en la aterosclerosis134, por nombrar algunos. Una limitación del uso de la microscopía de Brillouin para medir las propiedades elásticas proviene de la necesidad de un conocimiento previo de la densidad y el índice de refracción del tejido. Además, la fiabilidad del método no es del todo sencilla en muestras biológicas heterogéneas, especialmente en estados dinámicos. Esto se debe a un posible desajuste entre los tiempos de la relación mecánica y el tiempo en que ocurren los eventos biológicos reales. Aunque existen latitudes para mejorar la resolución temporal del microscopio, por ahora, es crucial tener en cuenta las limitaciones y las estructuras de imagen que se pueden acomodar en el rango de velocidad más lento que la relajación acústica. Además, dado que los cambios mecánicos afectan el comportamiento químico y viceversa, las imágenes mecánicas y químicas correlativas pueden ser clave para revelar las relaciones causa-efecto en los procesos de la vida104. Además, la comprensión del hecho de que las actividades mecánicas son multifacéticas y no lineales y no una simple medida de rigidez contribuirá en gran medida a abordar correctamente las cuestiones biológicas.

Si bien los microscopios sin etiquetas tienen un enorme potencial en muchos aspectos de las muestras biológicas, algunos objetivos biológicos son más propicios para la microscopía óptica sin etiquetas y tienen una gran relevancia para la investigación biomédica; nos referimos a ellos como súper bioobjetivos (Tabla 1). Dadas las importantes mejoras de las últimas dos décadas en los microscopios ópticos sin etiquetas, existe un enorme margen para mejorar la velocidad, la resolución, la precisión cuantitativa, la selectividad y la posibilidad de realizar análisis automatizados.

Resolución: El interés en la microscopía de superresolución ha crecido rápidamente para aplicaciones biológicas para observar entidades más pequeñas en acción. Los métodos de superresolución basados ​​en fluorescencia como STORM, STED, PALM y SR-SIM135 satisfacen esta demanda. El tremendo interés en la superresolución y las limitaciones asociadas con el etiquetado motivaron la nanoscopia óptica sin etiquetas. Hoy en día, el reino de la nanoscopia sin etiquetas existe con bioaplicaciones demostradas en imágenes de fase34, imágenes fotoacústicas73, autofluorescencia81 y SHG6. La promesa de estos se beneficiaría aún más del refuerzo mediante la resolución de la especificidad y la caracterización de artefactos.

Velocidad: La realización de imágenes ultrarrápidas no es nueva. Se puede acelerar el tiempo de obtención de imágenes sin comprometer la calidad de la imagen mediante el uso de hardware óptico innovador que incluye iluminación modelada, enfoque ultrarrápido y detección eficiente136,137. El objetivo principal es capturar movimientos rápidos en el cuerpo a través de escalas que van desde el corazón latiendo hasta el tráfico de carga subcelular. La velocidad de creación de imágenes tiene el costo de una captura eficiente de la información. Esto incluye la inclusión confiable de señales provenientes de la muestra y el manejo del ruido de manera eficiente sin comprometer la calidad de la imagen.

Precisión: la precisión de la imagen es la fidelidad de los sistemas de imagen para transmitir de forma fiable la información de la muestra. Los sistemas de ingeniería de iluminación, manejo de muestras y detección pueden mejorar la relación señal-ruido que disminuye los artefactos. Sin embargo, a menudo, el ruido es una parte inherente de la señal e incluso puede transportar información crucial que, cuando se explota, puede revelar información oculta. Así, la caracterización de lo que se percibe como ruido puede ser útil. Las simulaciones computacionales pueden modelar la interacción luz-muestra y, más específicamente, las señales que se espera que detecte el sistema microscópico. El desafío del modelado computacional actual es desenvolver tales circunvoluciones para explotar el llamado ruido que contribuye a una señal más utilizable por adquisición que conduce a imágenes más rápidas y precisas en los tres ejes espaciales.

Selectividad: la selectividad espacial implica obtener imágenes del espacio 3D preciso de la muestra. La precisión mejorada brinda información más selectiva al tiempo que rechaza señales de otros lugares. Por supuesto, esto es clave para integrar imágenes ópticas sin etiquetas en la investigación biológica convencional. Es fundamental en el diagnóstico médico donde la aparición de un componente específico es un marcador de enfermedad. La selectividad se puede abordar de muchas maneras. El más común es comparar puntos de referencia conocidos con estándares. Aunque a menudo se encuentra que los requisitos exactos para los estándares no se ajustan a un nuevo método y están hechos para ajustarse a los estándares existentes. La otra forma es encontrar factores de identificación inherentes como la forma o la textura. Por ejemplo, en el mapa de fase de las células, se ven tanto las mitocondrias como los filamentos de actina, y se puede usar QPM para distinguirlos mediante multiplexación virtual usando una medida como el índice de refracción. En la formación de imágenes de autofluorescencia, las medidas inherentes pueden ser simplemente los filtros de excitación y emisión para permitir la formación de imágenes de moléculas específicas.

Automatización: se pueden emplear herramientas computacionales para evaluar, identificar, aprender e informar a los usuarios finales sobre estructuras que de otro modo serían indistinguibles. Esta puede ser una tarea de gran volumen durante su desarrollo, pero este etiquetado virtual de las estructuras específicas puede ser gratificante a largo plazo para los servicios de alto rendimiento, como la detección clínica y la asistencia en el diagnóstico. El aprendizaje profundo es una herramienta poderosa para lograr tareas como la clasificación entre grupos de prueba. Sin embargo, es importante darse cuenta de la base de las decisiones computacionales. Actualmente de interés para los científicos computacionales que trabajan en redes neuronales interpretables con potencial en la extracción de conocimiento y descubrimientos fundamentales.

Por lo tanto, la microscopía óptica sin etiquetas ha recorrido un largo camino para superar los límites de las imágenes en vivo imperturbables y multifacéticas de los procesos biológicos. Pero un punto de dolor sostenido es el problema de la fototoxicidad que existe en las técnicas de microscopía óptica hoy en día causada por la luz de iluminación. Es un gran problema en la formación de imágenes fluorescentes138. En el dominio sin etiquetas, la fototoxicidad con iluminación de banda ancha como QPM es relativamente baja24 pero aún es significativa en modalidades basadas en láser como SHG, CARS e imágenes espectrales (hasta GW/cm2 con pulsos de láser de femtosegundo)139. La fototoxicidad introduce diminutos cambios moleculares y genéticos que limitan la obtención de imágenes de la vida verdaderamente imperturbables. Dado que la fototoxicidad depende de múltiples factores, incluido el tipo de microscopía, la elección de la longitud de onda, la preparación de la muestra y el tipo de muestra. Por lo tanto, es necesario desarrollar protocolos y sistemas para garantizar las mejores prácticas en imágenes en vivo.

Cuando se trata de bioimágenes, el todo es realmente mayor que la suma de las partes. Los cinco aspectos del desarrollo de un microscopio sin etiquetas (Fig. 3) ampliarán la esfera general de captura de más detalles ocultos. Sin embargo, seguirán surgiendo microscopios con mejor resolución, velocidad y campo de visión, pero esto por sí solo puede no ser suficiente para responder preguntas fundamentales en biología y, por lo tanto, integrarse en la investigación biológica. Es necesario emprender estrategias para garantizar la integración en lugar de la aplicación. La combinación de varias microscopías ópticas sin etiquetas puede beneficiarse del aspecto multimodal que puede complementarse entre sí al completar las partes faltantes de un estudio. Además, la obtención de imágenes correlativas de métodos sin etiquetas y basados ​​en etiquetas puede potenciar aún más no solo la bioinvestigación, sino también crear nuevas áreas de nicho para el uso de la microscopía sin etiquetas. Las técnicas de etiquetado y microscopía de fluorescencia están probadas y no solo son caballos de batalla para obtener resultados de alta precisión y alto rendimiento, sino también los principales impulsores para acercar la microscopía a los científicos de la vida al crear hitos que han dado forma a nuestra comprensión de la vida actual. Los desarrollos de sondas como las proteínas endógenas y los colorantes aptos para células vivas también se adaptan a las imágenes en vivo. Sin embargo, existe una complementariedad entre los microscopios basados ​​en etiquetado y los microscopios sin etiquetas. Comprender la complementariedad bidireccional es comprender mejor los misterios de la vida. Las etiquetas nos ayudan con la confianza en la especificidad en el mar de miles de moléculas. Los microscopios sin etiquetas proporcionan las características biológicas en su conjunto y, por lo tanto, están repletos de información. Por lo tanto, los cambios en un sistema a menudo se pueden observar con tales métodos y ayudar en la formulación de hipótesis. Los métodos basados ​​en etiquetas pueden ayudar a extraer resultados clave de este mar de información usando etiquetas específicas para validar o invalidar tales hipótesis. Por lo tanto, los estudios deben funcionar con un apretón de manos entre las dos microscopías para maximizar el resultado de la investigación en ciencias de la vida.

La figura ilustra el potencial de crecimiento tecnológico de los microscopios ópticos sin etiquetas. El círculo central muestra el límite actual de la microscopía óptica sin etiquetas, y los pétalos representan los diferentes aspectos en los que puede crecer y eventualmente ampliar el alcance de los microscopios sin etiquetas para imágenes biológicas. Sin embargo, el potencial de crecimiento real radica en gran medida en la integración de las técnicas en las rutinas biomédicas estándar.

Es necesario que surja el desarrollo de más herramientas adaptadoras que actúen como puentes entre los biólogos y los desarrolladores de microscopios sin etiquetas para que los microscopios sin etiquetas sean indispensables para los biólogos. Un buen ejemplo de una herramienta adaptadora de este tipo en el etiquetado fluorescente es el descubrimiento de la proteína de fluorescencia, GFP, que supuso un cambio revolucionario en la bioinvestigación a través de microscopios de fluorescencia. De manera similar, en el dominio libre de etiquetas, una herramienta adaptadora potencial pueden ser los fantasmas de calibración y cuantificación creados por la ingeniería de materiales para desarrollar objetivos bien definidos para el índice de refracción, la dispersión y los coeficientes de absorbancia140. Las etiquetas vibratorias141 para la calibración de enlaces químicos en imágenes espectrales como Raman, CARS y SRS también son buenos ejemplos de imágenes químicas. Los fantasmas que imitan tejidos142 con propiedades mecánicas definidas pueden permitir la elastografía microscópica. Esta integración de la investigación de imágenes con la investigación en química y ciencia de materiales para desarrollar herramientas de estandarización y evaluación comparativa para microscopios sin etiquetas puede tener un impacto duradero en la incorporación de estos microscopios a la corriente principal.

Otro desafío para llevar las imágenes sin etiquetas a la investigación biológica convencional es la necesidad de un esfuerzo activo para crear valor en las ciencias de la vida. Esto significa identificar puntos en común con las tecnologías probadas existentes y encontrar formas innovadoras de usar imágenes sin etiquetas para responder preguntas biológicas. Muchos métodos sin etiquetas, como IRM e iSCAT, se pueden agregar simplemente a las configuraciones de microscopios confocales existentes con algunas modificaciones. Más empresas derivadas están desarrollando microscopios de fase cuantitativa sin etiquetas y creando disponibilidad comercial con interfaces fáciles de usar, como los microscopios phi-optics Inc y nanolive143. Los métodos de microscopía no lineal basados ​​en dos fotones como SHG y CARS están disponibles comercialmente con empresas de microscopios de larga data como Zeiss y Leica. Otro enfoque es una colaboración a largo plazo entre los desarrolladores de microscopía y las instalaciones biológicas para establecer sistemas de trabajo en el sitio del experimento y trabajar en estrecha colaboración entre sí para refinar tanto el método como el valor biológico.

El beneficio de los microscopios sin etiquetas radica en la diversidad de aspectos biológicos que pueden monitorear, desde la modulación de la luz, el intercambio de energía, la química y la mecánica. Todas estas propiedades son inherentes a los materiales biológicos y, por lo tanto, son información en sus estados nativos libres de perturbaciones externas para resolver las cuestiones candentes que existen en la biología actual. Por lo tanto, los formuladores de políticas, las agencias de financiación, los inversores y la industria deben aprovechar el potencial de la microscopía sin etiquetas con la biociencia y motivar a una gran fuerza laboral dedicada a lograr tales actividades en el futuro.

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Financiamiento de acceso abierto proporcionado por UiT The Arctic University of Norway (incluido el Hospital Universitario del Norte de Noruega).

UiT - Universidad Ártica de Noruega, Tromsø, Noruega

Biswajoy Ghosh y Krishna Agarwal

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BG y KA conceptualizaron y revisaron el artículo. BG escribió el artículo y diseñó las figuras.

Correspondencia a Biswajoy Ghosh o Krishna Agarwal.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores principales de manejo: Marco Fritzsche y Manuel Breuer. Un archivo de revisión por pares está disponible.

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Ghosh, B., Agarwal, K. Viendo la vida sin etiquetas bajo microscopios ópticos. Commun Biol 6, 559 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04934-8

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Recibido: 21 febrero 2023

Aceptado: 12 de mayo de 2023

Publicado: 25 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04934-8

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