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Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 48 (2023) Citar este artículo

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La biopsia es el estándar recomendado para el diagnóstico anatomopatológico del carcinoma hepático. Sin embargo, este método generalmente requiere seccionamiento y tinción, y patólogos bien capacitados para interpretar imágenes de tejido. Aquí, utilizamos la espectroscopia Raman para estudiar muestras de tejido hepático humano, desarrollando y validando un flujo de trabajo para el diagnóstico patológico in vitro e intraoperatorio del cáncer de hígado. Distinguimos los tejidos de carcinoma de los tejidos no tumorales adyacentes de una manera rápida, no disruptiva y sin etiquetas mediante el uso de espectroscopia Raman combinada con aprendizaje profundo, que se valida mediante metabolómica tisular. Esta técnica permite la identificación patológica detallada de los tejidos cancerosos, incluido el subtipo, el grado de diferenciación y el estadio del tumor. Las imágenes Raman 2D/3D de cortes de tejido humano sin procesar con resolución submicrométrica también se adquieren en función de la visualización de la composición molecular, lo que podría ayudar en el reconocimiento de los límites del tumor y el diagnóstico clinicopatológico. Por último, se ilustra el potencial de un sistema Raman portátil de mano durante la cirugía para el diagnóstico intraoperatorio en tiempo real del cáncer de hígado humano.

El cáncer de hígado fue el séptimo cáncer más frecuente y la tercera causa principal de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo en 20201. La incidencia de casos recién diagnosticados y las tasas de incidencia de cáncer de hígado estandarizadas por edad han seguido aumentando a nivel mundial en las últimas décadas, a pesar avances en diagnóstico y terapia2,3.

Por lo tanto, el diagnóstico preciso y oportuno es crucial para el tratamiento del cáncer de hígado y la mejora de la tasa de supervivencia. Las pruebas serológicas combinadas con imágenes son el método estándar para el diagnóstico del carcinoma hepático4. Sin embargo, la sensibilidad diagnóstica de la prueba serológica más utilizada, que analiza la alfafetoproteína (AFP), es de ~60 %5. Las pruebas de imagen como la resonancia magnética nuclear (RMN), la tomografía computarizada (TC) y la ultrasonografía (US) tienen una alta sensibilidad y especificidad para la detección del cáncer de hígado, especialmente en pacientes con cirrosis hepática6. Tales pruebas de imagen, sin embargo, adolecen de resolución espacial limitada, complejidad en el diagnóstico intraoperatorio y/o conllevan riesgo de exposición a radiaciones ionizantes7. Por lo tanto, la biopsia aún se recomienda como estándar de oro para el diagnóstico patológico, lo que es importante para el pronóstico y la orientación del tratamiento4.

Clínicamente, las observaciones histopatológicas suelen realizarse con hematoxilina y eosina (H&E) o tinción inmunohistoquímica. El procedimiento de tinción requiere mucho tiempo y solo es adecuado para el diagnóstico utilizando tejidos aislados. Además, el número limitado de especialistas en patología puede restringir el uso de la histopatología6. Recientemente, la patología digital que utiliza análisis de imágenes de alto rendimiento ha ayudado mucho a los patólogos en la identificación y clasificación de muestras de tejido8,9. Sin embargo, la preparación de muestras para patología digital adolece de las mismas limitaciones que los métodos tradicionales. Por lo tanto, se necesitan técnicas para una investigación in vitro e incluso in vivo más rápida y no disruptiva del cáncer de hígado.

La histopatología espectral basada en la espectroscopia Raman proporciona un enfoque alternativo para el diagnóstico del cáncer10. La espectroscopia Raman es una técnica óptica basada en la dispersión inelástica de la luz por moléculas en vibración que proporciona huellas químicas de muestras biológicas complejas, y la mayor parte de la información biomolecular está disponible con solo una simple instantánea con la medición Raman. Es importante destacar que la estructura química y la composición de las muestras biológicas se pueden obtener mediante espectroscopia Raman sin manchas y de forma no destructiva con una preparación mínima de la muestra11,12,13,14. La información espectral también se puede combinar con algoritmos de inteligencia artificial para establecer un modelo de clasificación de diagnóstico que permita el diagnóstico automático15,16,17,18. Además, las imágenes de espectroscopia Raman permiten delinear los márgenes del tumor y visualizar las regiones lesionadas de interés que son invisibles a simple vista19. Estas características hacen que la espectroscopia Raman sea factible para el examen de muestras de tejido aisladas y la ayuda de los cirujanos para identificar los márgenes de los tumores, lo que facilita una extracción más completa con un daño mínimo al tejido normal.

Hasta el momento, se han realizado investigaciones sobre el uso de la espectroscopia Raman para el diagnóstico patológico de varios tejidos biológicos, incluidos el cerebro20, la mama21, la piel22,23, el colon24 y la vejiga25. Para el cáncer de hígado, los estudios basados en la espectroscopia Raman se han centrado principalmente en el análisis de muestras de sangre, con solo unos pocos estudios dirigidos al tejido humano.

Además, se sabe que la heterogeneidad de los tejidos tumorales y la posible infiltración del carcinoma aumentan la variabilidad de los datos espectrales recogidos de los tejidos. Por lo tanto, es necesario recopilar una gran cantidad de espectros de cada muestra de tejido para representar mejor los datos, pero esto puede aumentar la complejidad del análisis de datos y plantear un desafío para los métodos quimiométricos tradicionales. La naturaleza basada en datos del aprendizaje profundo es adecuada para resolver este problema17. El aprendizaje profundo puede extraer y aprender características ocultas directamente de datos masivos y se ha aplicado con éxito en el campo del reconocimiento de imágenes, incluido el análisis de imágenes biológicas y médicas26,27,28. Gracias a la flexibilidad de su arquitectura, el aprendizaje profundo también se ha extendido para analizar datos secuenciales unidimensionales, como los datos espectrales29,30. Algunos informes describieron el aprendizaje profundo para el diagnóstico médico utilizando datos espectrales 1-D Raman18,31.

En este estudio, informamos la exploración del tejido de hepatopatía humana mediante espectroscopia Raman. Primero distinguimos con éxito los tejidos de carcinoma hepático de los tejidos no tumorales adyacentes mediante espectroscopia Raman combinada con una red neuronal convolucional (CNN) basada en VGG-16, de una manera rápida, no disruptiva y sin etiquetas. Luego se hizo una identificación patológica más detallada de los tejidos de cáncer de hígado, incluido el subtipo, el grado de diferenciación y el estadio del tumor. El análisis de metabolómica tisular confirmó la fiabilidad de la espectroscopia Raman en la identificación de metabolitos. Además, las imágenes Raman de bloques de tejido humano sin procesar y cortes de tejido con resolución submicrométrica permitieron visualizar su composición molecular, lo que facilitó la identificación de los límites del tumor y el diagnóstico clinicopatológico. Finalmente, se empleó un sistema de espectroscopia Raman portátil durante la cirugía para explorar la viabilidad del diagnóstico de cáncer de hígado intraoperatorio en tiempo real. En la figura 1 se muestra un flujo de trabajo gráfico del diagnóstico histopatológico del tejido hepático y el diagnóstico intraoperatorio basado en la espectroscopia Raman y un algoritmo inteligente.

Se recopilaron grandes conjuntos de datos Raman adquiridos a partir de tejido hepático y se introdujeron en un modelo de aprendizaje profundo basado en CNN para entrenarlo para distinguir datos espectrales de diferentes tipos de tejido. Luego, el modelo se usó para diferenciar diferentes tipos patológicos de tejidos de cáncer de hígado. Además, los resultados de Raman se validaron mediante metabolómica tisular basada en cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS). Además, se utilizaron imágenes Raman para visualizar la composición molecular de bloques de tejido humano sin procesar y cortes de tejido. Finalmente, se empleó un sistema Raman portátil durante la cirugía para el diagnóstico intraoperatorio en tiempo real del cáncer de hígado.

Se usó una longitud de onda de excitación de 532 nm para las mediciones de Raman que se informan aquí, mientras que las longitudes de onda más largas se recomiendan generalmente para el análisis de muestras biológicas para evitar las señales de fondo de fluorescencia y obtener una penetración de luz más profunda. Sin embargo, en comparación con longitudes de onda más largas (como 633 o 785 nm, respectivamente), las longitudes de onda más cortas proporcionaron una mayor calidad de datos y una relación señal-ruido para los espectros Raman (Fig. 1 complementaria), que en parte resultó de la amplificación resonante de proteínas específicas. y bandas asociadas a carotenoides32.

Se adquirieron espectros Raman de tejidos de carcinoma hepático coincidentes y tejidos no tumorales adyacentes de 120 pacientes con cáncer de hígado. La información detallada del paciente se enumera en la Tabla complementaria 1. Debido a la heterogeneidad y la complejidad de los tejidos cancerosos (Figura complementaria 2), se recopilaron al menos 50 espectros de puntos seleccionados al azar en la superficie de cada muestra de tejido. En la Fig. 2a se muestra una comparación de los espectros Raman promedio obtenidos de muestras de tejido de carcinoma y paracarcinoma. Se observaron diecinueve picos Raman característicos de la mayoría de las muestras de tejido. Los picos Raman de los dos grupos se superpusieron en gran medida, pero la intensidad de cada pico en el grupo de tejido de paracarcinoma es significativamente mayor que en el grupo de tejido canceroso (prueba t de Student, P < 0,05). Se trazaron mapas de calor agrupados jerárquicamente de picos Raman característicos para discriminar previamente los picos Raman estrechamente relacionados (Fig. 3 complementaria). La Tabla complementaria 2 proporciona la posición máxima y los compuestos representativos correspondientes de los principales modos de vibración Raman informados en la literatura33.

a–d Los espectros Raman promedio de 120 muestras de tejido de carcinoma y 120 de paracarcinoma (a), muestras de tejido de cáncer de pacientes con CHC e ICC (b), muestras de tejido de CHC en diferentes estadios tumorales (c) y muestras de tejido de CHC con diferentes tipos de cáncer. grados de diferenciación celular (d). Las áreas sombreadas representan las desviaciones estándar de la media. e y f Fotografías típicas de tejido paracanceroso (izquierda) y muestra de tejido de cáncer de hígado (derecha) (e) y las imágenes correspondientes de los tejidos teñidos con H&E (f) de 120 muestras analizadas en este estudio. g Prueba Raman de tejido hepático con un espectrómetro micro-Raman. h La arquitectura del modelo de aprendizaje profundo basado en VGG-16. Los datos Raman que consisten en 12.000 espectros se introdujeron en la capa convolucional inicial con 64 filtros. Cada capa convolucional tenía un tamaño de kernel de 3 y se conectaba con una capa de activación de ReLU. Se utilizó una capa de abandono en las capas de conexión completa, siguiendo los bloques básicos. Se empleó Max-pooling (tamaño 2, paso 2) entre bloques para reducir la longitud de los datos. Los números debajo de cada bloque se refieren a la longitud y el número de canales de salida, respectivamente. i, j Pérdida de entropía cruzada (i) y precisión (j) en el entrenamiento iterativo de la CNN. La entropía cruzada representa el error cuadrático medio entre el valor predicho y el valor real. k Matrices de confusión binaria para la clasificación de cuatro categorías de tejidos basadas en el algoritmo CNN en porcentaje (%). l Curvas ROC y valores AUC correspondientes. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

La mayoría de los picos podrían atribuirse a aminoácidos aromáticos, proteínas y carotenoides. Específicamente, los picos en torno a 749, 1212, 1393, 1547, 1586 y 1602 cm−1 están relacionados con triptófano, tirosina o fenilalanina, respectivamente. La banda de 1637 cm−1 corresponde al estiramiento C = O de la banda de amida I. Las líneas Raman en 1003, 1156 y 1519 cm−1 representan el tramo C–C y C–N de los carotenoides. También se ha informado que el pico de 1003 cm−1 está asociado con AFP, un biomarcador para el carcinoma hepatocelular (HCC)34. Además, las características Raman que aparecen en 1081, 1130 y 1304 cm−1 están relacionadas principalmente con lípidos o ácidos grasos. Las bandas de 674, 974, 1336 y 1356 cm−1 pueden asignarse a ácidos nucleicos. Además, la firma Raman de alrededor de 835 cm−1 está relacionada con los sacáridos. Estas diferencias en los espectros Raman entre el tejido paracanceroso y el canceroso reflejan variaciones en los componentes bioquímicos del tejido hepático causadas por la carcinogénesis, lo que proporciona una base para diferenciar los tejidos cancerosos de los normales.

A continuación, se exploró más a fondo la diferenciación histopatológica fina del cáncer de hígado basada en la espectroscopia Raman. El cáncer primario de hígado es uno de los cánceres más comunes en todo el mundo, de los cuales el 75-85% y el 10-15% son carcinoma hepatocelular (CHC) y colangiocarcinoma intrahepático (ICC), respectivamente35. Como se muestra en la Fig. 2b, las principales diferencias en la intensidad de la señal Raman entre los grupos HCC e ICC estaban en los picos Raman relacionados con los carotenoides (1003, 1156 y 1519 cm-1), que eran significativamente más altos en el grupo ICC. Por el contrario, la mayoría de los picos relacionados con aminoácidos, lípidos y ácidos nucleicos, como 749, 974, 1304, 1356, 1393 y 1586 cm−1, respectivamente, fueron más altos en el grupo de HCC. Además, un juicio preciso del estadio del tumor y el grado de diferenciación puede ayudar en la elección de la estrategia de tratamiento y la evaluación del pronóstico. Como se muestra en la Fig. 2c, las principales diferencias espectrales entre las etapas temprana y avanzada se encontraron en 1003, 1156, 1519 cm−1 (carotenoides), 1130 cm−1 (ácidos grasos), 749 y 1547 cm−1 (triptófano), que tuvo mayor intensidad en el grupo de etapa temprana, mientras que los picos relacionados con los ácidos nucleicos a 674 y 974 cm−1, y sacárido a 835 cm−1 fueron más altos en el grupo de etapa avanzada. Además, la Fig. 4 complementaria muestra los espectros Raman de diferentes categorías de diferenciación del cáncer. La diferencia espectral general entre los grupos moderadamente y pobremente diferenciados fue más significativa que la de los grupos bien y moderadamente diferenciados. De manera similar a las diferencias entre los grupos con cáncer y paracáncer, los grupos bien y moderadamente diferenciados también exhibieron una intensidad espectral general más alta, especialmente en los picos relacionados con los carotenoides (Fig. 2d). El patólogo volvió a confirmar el tipo patológico de cada bloque de tejido con base en la tinción H&E después de la prueba Raman (Fig. 2e-g).

Para clasificar diferentes tipos de tejidos hepáticos utilizando espectros Raman, se empleó un modelo CNN basado en la red VGG-16. La arquitectura del modelo constaba de 13 capas convolucionales unidimensionales, 5 capas de agrupación y 3 capas completamente conectadas (como se muestra en la Fig. 2h), utilizando el apilamiento de núcleos de convolución a pequeña escala en lugar de núcleos de convolución a gran escala para reducir los parámetros necesarios para cálculos36. Se estableció una base de datos Raman de tejido hepático con 50 espectros por muestra de tejido y se obtuvo un total de 12 000 espectros de 120 pares de muestras de tejido hepático. Los datos espectrales oscilaron entre 500 y 2000 cm−1 con 889 datos flotantes unidimensionales. Se construyó un modelo de clasificación binaria para clasificar el tejido de cáncer de hígado y el tejido paracanceroso, que se designaron como 1 y 0, respectivamente. Los datos espectrales se preprocesaron con sustracción y suavizado de línea base y luego se introdujeron en el modelo CNN con una mezcla aleatoria. La función softmax se usó como la función de activación en la capa de salida, que genera probabilidades de dos clases con el valor más alto considerado como la clase predicha.

La precisión y la pérdida de entropía cruzada son dos indicadores que se utilizan a menudo para evaluar el rendimiento y la fiabilidad de los modelos CNN. Con las iteraciones de aprendizaje, las curvas de precisión y pérdida de entropía cruzada del conjunto de validación tienden gradualmente a converger, lo que indica que el modelo no se ajusta en exceso (Fig. 2i, j). Como resultado, se obtuvo una precisión del 92,6 % para estimar el área de tejido del carcinoma, acompañada de una sensibilidad y especificidad del 90,8 % y 94,6 %, respectivamente.

Además, se establecieron otros tres modelos de CNN para distinguir HCC de tejidos ICC y entre tejidos con diferentes etapas de cáncer y grados de diferenciación. El desempeño de cuatro modelos binarios se muestra en las matrices de confusión de la Fig. 2k. La heterogeneidad tumoral planteó un desafío en la discriminación de diferentes estadios y grados de diferenciación de los tejidos tumorales, con precisiones del 78,3 % y 72,3 %, respectivamente. Pero se obtuvo un mejor resultado para la clasificación de los subtipos de cáncer de hígado HCC e ICC, con una precisión de identificación del 82,4 %. Se trazaron cuatro curvas de características operativas del receptor (ROC) para verificar cuantitativamente el rendimiento de los clasificadores (Fig. 2l), con valores del área bajo la curva (AUC) entre 0,783 y 0,965. Además, en comparación con otros algoritmos comunes de aprendizaje automático, incluidos PLS-DA, Random Forest y XGBoost, el enfoque de aprendizaje profundo muestra un rendimiento computacional superior con mayor precisión en la identificación de tejidos de diferentes tipos patológicos, especialmente al tratar con datos desequilibrados (Tabla complementaria 3 ).

Vale la pena señalar que el diagnóstico convencional de CHC basado en un único biomarcador serológico (como la AFP) logró poca sensibilidad en este estudio. Con un umbral de AFP de 200 ng/ml, 25 de 92 pacientes con CHC dieron positivo, con una sensibilidad de solo el 27,2 % (Fig. 5 complementaria), mucho más baja que nuestro método basado en mediciones Raman. Además, las modalidades de imagen como la TC y la RM se recomiendan como métodos diagnósticos de primera línea para identificar o predecir diferentes estados patológicos del CHC37,38. Por ejemplo, la estadificación clínica del CHC se diagnostica principalmente en función de las características de imagen, incluidos el número y el tamaño de los nódulos de CHC y la presencia de invasión vascular. Aquí, los espectros Raman también han demostrado la viabilidad para la determinación de la invasión microvascular con una precisión del 67 % y un valor de AUC de 0,694 basado en 84 pacientes (Fig. 6 complementaria). Los resultados pueden mejorarse con un aumento adicional en el número de muestras y colecciones espectrales. En resumen, en términos de precisión, la espectroscopia Raman es comparable o mejor que las modalidades de imágenes tradicionales (como CT, MRI y US) para identificar diferentes tipos de patologías en el estudio actual (Tabla complementaria 4), lo que proporciona un poderoso complemento a las pruebas existentes. Técnicas de diagnóstico de patología.

Para confirmar aún más los cambios en la composición bioquímica de los tejidos de cáncer de hígado, se empleó una estrategia de metabolómica no dirigida basada en cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS). La metabolómica tisular se usa ampliamente en el estudio de la patogenia de la enfermedad en función de las características metabólicas39,40, lo que puede proporcionar información directa sobre las alteraciones metabólicas en sitios específicos y revelar biomarcadores tumorales relevantes. En este estudio se evaluó un total de 25 pares de tejidos HCC compatibles y tejidos no tumorales adyacentes. Los iones de 1995 y 2228 se retuvieron en los modos de fuente de ionización por electropulverización positiva y negativa (ESI+ y ESI-), respectivamente (Datos complementarios 1), después de eliminar la desviación y los valores faltantes. En total, se identificaron y seleccionaron 57 metabolitos en modo ESI+ y 51 en modo ESI− como metabolitos diferenciales candidatos (Datos complementarios 2). Las diferencias entre nueve tipos de metabolitos primarios y el mapa de calor agrupado jerárquicamente de 108 biomarcadores metabólicos específicos entre tejidos con HCC y tejidos no tumorales adyacentes se trazaron en la Fig. 3a y b. La mayoría de los metabolitos exhibieron una tendencia a la baja en los tejidos con CHC, lo que es coherente con la menor intensidad de Raman en los tejidos con CHC.

a Distribuciones de abundancia relativa para nueve tipos de metabolitos diferenciales entre muestras de tejido de HCC y muestras de tejido no tumoral adyacentes coincidentes, como una relación con la mediana de la abundancia relativa en los tejidos no tumorales. i–ix representan metabolitos de tirosina (i), aminoácidos no aromáticos (ii), ácidos grasos (iii), PC marcadas con PUFA (iv), PC marcadas con SFA y MUFA (v), carnitinas (vi), nucleósidos (vii), bases y sus derivados (viii), y sacáridos (ix). b Mapa de calor agrupado jerárquicamente de 108 metabolitos significativamente diferenciales entre tejidos con CHC y tejidos no tumorales adyacentes según la distancia euclidiana. Los bloques se colorearon según los niveles de expresión relativos de los metabolitos. Púrpura indica alta expresión; naranja claro indica baja expresión. c Contenido diferencial de aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina y triptófano) entre tejidos con HCC y tejidos no tumorales adyacentes. Se observó un aumento significativo de tirosina en el grupo de paracáncer (prueba t de Student de dos colas, P < 0,05), y también se observaron niveles más altos de triptófano y fenilalanina, pero los cambios no fueron significativos (prueba t de Student de dos colas , p > 0,05). Los diagramas de caja muestran la media, la mediana y los cuartiles inferior/superior; los bigotes muestran cercas internas. d Contenidos de fosfatidilcolinas representativas (i), nucleósidos, bases y sacáridos (ii) con diferencias significativas entre los tejidos HCC y los tejidos adyacentes. Los datos se presentan como valores medios ± SD. Tejidos HCC, n = 25, tejidos adyacentes, n = 25. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Por ejemplo, se observó una regulación a la baja significativa de la tirosina en los tejidos de HCC, mientras que los otros dos aminoácidos aromáticos (ArAA), fenilalanina y triptófano, no tuvieron cambios significativos (Fig. 3a (i) y Fig. 3c). Sin embargo, encontramos disminuciones de otros compuestos aromáticos en los tejidos de HCC, incluida la dopa, el ácido 3-hidroxiantranílico y la anilina, lo que sugiere que las variaciones en las bandas Raman relacionadas con el anillo de benceno de los tejidos hepáticos también podrían derivar de los derivados de ArAA u otros metabolitos aromáticos. Además, también se encontró que la mayoría de los AA no aromáticos, como la β-alanina, la glicina, la asparagina, el glutatión y la treonina, disminuyen en los tejidos de HCC (Fig. 3a (ii)). Sin embargo, la arginina aumentó en el grupo de HCC, lo que podría atribuirse a la supresión de la enzima degradante de arginina arginasa I (ARG1), y también se informó que la arginina promueve el crecimiento tumoral41.

El hígado es el sitio principal para la síntesis de lípidos y ácidos grasos. La lesión de los hepatocitos puede alterar la función hepática y provocar una disfunción del metabolismo de los lípidos42. Por ejemplo, a excepción del ácido eicosadienoico y el ácido nervónico, la mayoría de los ácidos grasos, especialmente los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA), están regulados a la baja en los tejidos de HCC (Fig. 3a (iii)). Además, la fosfatidilcolina (PC) es un componente significativo de las membranas celulares y puede ser oxidada por especies reactivas de oxígeno43. En este estudio, los niveles de PC etiquetados con PUFA se redujeron significativamente en el grupo de HCC (Fig. 3a (iv)), lo que podría atribuirse a la oxidación de PUFA en presencia de alto estrés oxidativo en tejido canceroso, lo que resulta en una aumento adicional de PC etiquetadas con ácidos grasos saturados (SFA) o ácidos grasos monoinsaturados (MUFA) (Fig. 3a (v) y Fig. 3d (i)). Además, se observaron aumentos en las acilcarnitinas de cadena larga y disminuciones en las acilcarnitinas de cadena corta o media, como propionilcarnitina y hexanoilcarnitina (Fig. 3a (vi)).

Los hepatocitos juegan un papel esencial y típicamente están involucrados en el metabolismo de los nucleótidos. También se observó el desorden de algunos nucleósidos, bases y metabolitos relacionados (Fig. 3a (vii-viii)), que estaban principalmente relacionados con el metabolismo de las purinas. Los metabolitos de purina que participan en la síntesis de ADN y ARN son fundamentales para promover la supervivencia y proliferación celular44. A excepción de la inosina, la mayoría de los metabolitos de purina mostraron una regulación a la baja en el grupo de HCC, incluidos xantina, hipoxantina, xantosina, desoxiinosina, uridina, ácido úrico y adenina (Fig. 3d (ii)), que puede atribuirse a la disminución de la actividad de relacionados enzimas metabólicas45.

La mayoría de los sacáridos y metabolitos relacionados, como la d-ribosa, la d-sedoheptulosa, el ácido d-glucurónico, la d-tagatosa y la sacarosa, se redujeron significativamente en los tejidos de HCC (Fig. 3a (ix) y d (ii)). Sin embargo, se observó un alto nivel del metabolito de la glucólisis glucosa 6-fosfato en el grupo de HCC, mientras que los metabolitos del ciclo del ácido tricarboxílico (TCA), incluidos el ácido fumárico y el ácido succínico, estaban regulados a la baja, como se informó anteriormente46. Los cambios en estos metabolitos relacionados con la energía sugieren un gasto rápido de glucosa a través del aumento de la glucólisis aeróbica en las células cancerosas, lo que podría deberse al efecto Warburg47.

Además, se observó que varios metabolitos aumentaron significativamente en los tejidos del CHC, incluidos el glutatión, la 5'-metiltioadenosina, el ácido 3,4,5-trimetoxicinámico, el ácido oxoadípico y la 2-oxoarginina, que tienen el potencial de ser biomarcadores del cáncer de hígado. detección (Fig. 3b y Datos complementarios 2). Para comparar las diferencias de metabolitos anteriores de manera más intuitiva, la representación de los cambios relativos de las muestras de CHC sobre los respectivos tejidos adyacentes se muestra en la figura complementaria 7. Además, el poder predictivo de la metabolómica también fue investigado por el modelo CNN utilizado para el análisis espectral para distinguir los tejidos de CHC. de tejidos adyacentes no tumorales. La precisión está entre el 70 % y el 80 %, que es inferior a los resultados del análisis espectral, pero la precisión puede mejorarse aumentando el número de muestras.

Debido a la heterogeneidad de los tejidos tumorales y las diferencias entre los pacientes, las variaciones en los datos Raman entre las muestras de tejido son inevitables (Fig. 2 complementaria), lo que es un desafío para la discriminación general de diferentes tejidos. Sin embargo, para el cáncer de hígado emparejado y los tejidos no tumorales adyacentes del mismo paciente, se observaron fácilmente diferencias en la intensidad de Raman en la mayoría de las muestras. Por lo tanto, sugerimos que la tecnología de espectro sin etiquetas que se describe aquí puede incorporar algoritmos de análisis de imágenes apropiados para visualizar los márgenes del cáncer y facilitar la delineación intraoperatoria del tumor.

Para probar esto, se seleccionaron dos bloques de tejido de cáncer de hígado para exploración Raman. Como se muestra en la Fig. 4a yb, los dos bloques de cáncer de hígado y las imágenes teñidas con H&E correspondientes validaron la existencia de cancerización de hepatocitos en la que el cordón hepático tenía una disposición desordenada con mayor densidad celular y relación nuclear/citoplasmática. Las imágenes de campo claro para la región de prueba de mapeo de los tejidos de cáncer de hígado se muestran en la Fig. 4c. La tecnología LiveTrack se utilizó para ajustar continuamente la altura de la muestra para mantener la muestra enfocada. Los datos de altura de la superficie se registraron durante las mediciones de Raman, y las imágenes de perfil de superficie tridimensionales (3D) de las dos muestras de tejido se muestran en la Fig. 4c, con diferencias de altura máximas de 38,2 y 27,4 µm, respectivamente. Las imágenes Raman se analizaron con resolución de curva de automodelado (SMCR) y algoritmos de análisis de conglomerados jerárquicos (HCA). El método SMCR podría resolver el conjunto de datos de mapeo Raman desconocido en espectros de componentes puros, produciendo imágenes de concentración y espectro puro simultáneamente (como se describe en la sección "Métodos"). Se obtuvieron imágenes de alta calidad basadas en el método SMCR (Fig. 4d). En la primera muestra de tejido se pudo ver un borde distintivo de la región cancerosa, donde las regiones de carcinoma y parénquima hepático se distinguieron con éxito como se muestra en diferentes pseudocolores. Los límites del tumor no eran uniformes en las imágenes Raman (Fig. 4d y e, panel superior), probablemente debido a la cápsula tumoral delgada y al área de imagen pequeña (50 × 50 μm) con intervalo de escaneo a escala micrométrica (2 μm). El segundo tejido mostró un borde de cáncer relativamente pobre en el área mostrada (Fig. 4d y e, panel inferior), entremezclándose con el parénquima hepático, probablemente debido a la presencia de infiltración cancerosa, que era apenas detectable en imágenes de campo claro. Estas lesiones cancerosas se confirmaron mediante tinción con H&E (Fig. 4b). HCA fue otro método quimiométrico utilizado aquí para combinar un conjunto de espectros en grupos con espectros similares de una manera más abstracta. Los resultados de las imágenes derivadas de HCA (Fig. 4e) son consistentes con los procesados con SMCR (Fig. 4d), lo que indica la confiabilidad de los algoritmos de procesamiento de imágenes.

a Fotografías de dos bloques de cáncer de hígado seleccionados; las flechas apuntan a las posiciones de las regiones de imágenes Raman. b Las imágenes locales teñidas con H&E de los dos tejidos hepáticos y los recuadros blancos en la fila inferior son las áreas de imágenes Raman aproximadas. c Imágenes de campo claro (50 × 50 µm) de la región de prueba de mapeo (izquierda) e imágenes de perfil de superficie 3D correspondientes construidas con tecnología LiveTrack (derecha) de dos muestras. Las imágenes Raman d, e derivadas de SMCR (d) y derivadas de HCA (e) muestran márgenes de cáncer para las muestras de tejido hepático. f Espectros típicos recopilados de los puntos 1-8 indicados en (d); los puntos 1, 2, 5 y 6 son de las regiones putativas de paracarcinoma o no tumorales y 3, 4, 7 y 8 son de las regiones putativas de carcinoma. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para demostrar aún más la variación espectral en diferentes regiones de la superficie del tejido hepático, recolectamos espectros (Fig. 4f) de varios lugares marcados con puntas de flecha en la Fig. 4d. Los puntos 1, 2, 5 y 6 se recolectaron de regiones putativas de paracarcinoma y no tumorales y exhibieron una intensidad Raman más alta que las recolectadas de regiones putativas de carcinoma (puntos 3, 4, 7 y 8) en ambos bloques de tejido. Esta diferencia de la firma Raman proporciona una base para el reconocimiento de algoritmos de imágenes, lo que respalda nuestra expectativa inicial de detección de márgenes tumorales de alta precisión mediante la técnica Raman. Además, también se pueden obtener imágenes Raman más grandes utilizando un objetivo de bajo aumento y/o aumentando el intervalo de exploración con la ayuda del potente algoritmo de imagen (Fig. 8 complementaria).

Para verificar las capacidades clinicopatológicas y diagnósticas de la espectroscopia Raman, utilizamos un espectrómetro micro-Raman para obtener imágenes de cortes de tejido hepático humano sin teñir con un grosor de 5 µm. Primero adquirimos espectros originales en el rango de 2000–3400 cm−1 (Fig. 5a). Los espectros de tejido contenían un pico prominente a 2930 cm−1, que está relacionado con el estiramiento de CH3 en las proteínas48. Además, se detectaron varios picos Raman característicos relacionados con los lípidos a 2855, 2885 y 3007 cm−1, que se atribuyeron a la vibración simétrica del CH2 de los lípidos, la resonancia de Fermi o vibración asimétrica del CH2 en cadenas acilo rectas largas saturadas y la vibración no saturada del CH2. = tramo CH en cadenas acilo, respectivamente49. La adquisición de imágenes Raman en modo StreamHR se realizó en el cáncer de hígado no teñido y en las secciones de tejido adyacente con una resolución de 0,8 µm en las dos direcciones axiales. Se realizó un análisis multivariado de los datos cartográficos Raman para reconstruir mapas de distribución espacial de los principales componentes químicos de los tejidos. Los espectros Raman de proteínas y lípidos puros también se resolvieron mediante el algoritmo SMCR (Fig. 5a). Los mapas de concentración de proteínas y lípidos reconstruidos por SMCR en tejido hepático normal se muestran en la Fig. 5b y c, respectivamente. Para comprender mejor su distribución espacial relativa, en la Fig. 5d se muestra una imagen de superposición de color de ambos.

un espectro Raman típico de cortes de tejido hepático en el rango de 2000–3400 cm−1 (línea morada); los espectros Raman de proteína pura (línea azul) y lípidos (línea amarilla) también se resuelven mediante el algoritmo SMCR. El pico Raman a 2930 cm−1 (flecha 3) está relacionado con la proteína, y los picos alrededor de 2855 cm−1 (flecha 1), 2885 cm−1 (flecha 2) y 3007 cm−1 (flecha 4) son característicos de lípidos mapas de concentración b-d SMCR reconstruidos de lípidos (b) y proteína (c) en tejido hepático normal; d es una superposición de los dos. Para fusionar las dos imágenes, se ajustó el valor LUT mínimo de amarillo (lípidos). e–i Imágenes de campo claro del área de prueba de mapeo y Raman derivado de SMCR teñido con H&E correspondiente, e imágenes de perfil de superficie 3D correspondientes de tejido hepático normal (e). f–i muestran otras regiones tisulares con morfologías típicas, incluida la cancerización (f), la esteatohepatitis (g), la fibrosis (h) y los tejidos conectivos (i). Todas las barras de escala son de 10 µm.

A continuación, se compararon las imágenes Raman del parénquima hepático normal típico (Fig. 5e) y las áreas cancerosas (Fig. 5f). Las imágenes Raman superpuestas de proteínas y lípidos y las correspondientes imágenes de perfil de superficie 3D, imágenes de campo claro e imágenes teñidas con H&E del área de prueba se muestran en la Fig. 5e y f. Las imágenes derivadas del algoritmo SMCR exhibieron una estructura subcelular clara en pseudocolor, revelando variaciones en la concentración de lípidos y proteínas. En el tejido hepático normal, las proteínas se encontraban en concentraciones más altas en la región nuclear y los lípidos se distribuían principalmente en las regiones periféricas de las células hepáticas. Mientras que en las células cancerosas, las proteínas se distribuyen principalmente cerca de la membrana celular con menos células en el interior. Vale la pena señalar que tales diferencias en la distribución espacial de los componentes bioquímicos suelen ser difíciles de discernir en las imágenes teñidas con H&E. Además, en las imágenes Raman también se observaron cambios típicos durante la transformación de las células cancerosas, como la disposición irregular de los hepatocitos y una mayor proporción nuclear/citoplasmática, lo que concuerda con los campos brillantes y la tinción H&E. Además de las imágenes planares, se obtuvieron imágenes de perfil de superficie en 3D, que combinaron información sobre la composición química con la topografía de la superficie del tejido.

Además de los tejidos normales y cancerosos, se realizaron escaneos Raman en varias otras regiones de tejido con morfologías típicas, que incluyen esteatohepatitis, tejido fibrótico y conectivo (Fig. 5g-i). Estas imágenes Raman exhibieron varias características morfológicas de células y tejidos, como gotas de grasa y fibras de filamento, que estaban de acuerdo con las imágenes teñidas y de campo claro correspondientes. Todos los mapas de concentración individuales reconstruidos por SMCR de proteínas y lípidos en cortes de tejido se muestran en la Fig. 9 complementaria. Además de las imágenes histoquímicas bidimensionales (2D) en la superficie del tejido, también generamos imágenes 'z-stack' en tres dimensiones por espectroscopia Raman. La Fig. 10 complementaria muestra imágenes 3D reconstruidas de los cinco cortes de tejido de la Fig. 5. Las imágenes se reconstruyeron a partir de una pila de seis cortes en z (cortes de 5 µm) con cada plano cubriendo 50 µm × 3 µm, lo que proporcionó una profundidad histoquímica más abundante información de las muestras de tejido. En este estudio, la profundidad de detección máxima del tejido hepático mediante espectroscopia Raman confocal bajo un láser de 532 nm fue de aproximadamente 200 µm (Fig. 11 complementaria). Para la detección de tejidos más profundos, se puede aplicar la integración de la espectroscopia Raman desplazada espacialmente (SORS) para lograr una detección de profundidad a nivel centimétrico50.

Después de validar el rendimiento de la espectroscopia Raman en el diagnóstico y la obtención de imágenes del tejido hepático in vitro, investigamos más a fondo su viabilidad para el diagnóstico intraoperatorio en tiempo real del cáncer de hígado. Se empleó intraoperatoriamente un sistema de espectroscopia Raman portátil de mano hecho a medida para detectar el carcinoma hepático. El sistema estaba compuesto por un láser de fibra acoplada a 785 nm, una sonda de mano y un espectrómetro de fibra (los detalles se describen en la sección "Métodos"). El espectrómetro se conectó a una computadora personal con software de adquisición, generando información sobre los contenidos moleculares del tejido objetivo. Durante la operación, la sonda también estaba cubierta por una cubierta protectora estéril desechable, que tuvo un efecto insignificante en el espectro Raman medido (Fig. 12 complementaria).

La Figura 6 muestra los espectros Raman promedio de tejido hepático obtenidos a partir de mediciones intraoperatorias in vivo. La sonda se mantuvo por encima de la superficie del tejido para medir las señales Raman en varios puntos seleccionados al azar en el carcinoma y las regiones no tumorales adyacentes. La intensidad espectral Raman total de la región no tumoral fue significativamente mayor que la de la región tumoral. Esto es coherente con los resultados de las pruebas in vitro, aunque existe una diferencia entre los espectros de tejido recopilados por el espectrómetro Raman portátil y el espectrómetro micro-Raman (Fig. 13 complementaria). Las principales diferencias espectrales entre las regiones tumorales y no tumorales se encuentran en los picos relacionados con proteínas en 640, 976, 1024, 1540 y 1635 cm−1, picos relacionados con lípidos en 413, 775, 1314, 1381 y 1436 cm− 1 y picos asociados con ácidos nucleicos en 689, 1094 y 1514 cm−1. A medida que se adquieren más datos espectrales intraoperatorios, estas diferencias espectrales combinadas con algoritmos adecuados pueden ayudar a distinguir las regiones del parénquima hepático y del tumor en la cirugía, y otras técnicas de mapeo Raman intraoperatorio pueden hacer factible la visualización de los límites del tumor.

Se recogieron los espectros Raman promedio de las mediciones intraoperatorias in vivo para tejido de carcinoma y paracarcinoma de seis pacientes. Los espectros se recogieron mediante un sistema de espectrómetro Raman portátil de mano equipado con un láser NIR de 785 nm y un espectrómetro CCD computarizado. Las áreas sombreadas representan las desviaciones estándar de las medias. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

La espectroscopia Raman tiene el potencial de ser una herramienta versátil para el diagnóstico histopatológico del cáncer de hígado porque permite una detección rápida y una alta especificidad química basada en señales de vibración molecular intrínsecas. Específicamente, los espectros de cáncer de hígado mostraron una intensidad general más débil que los obtenidos de tejidos no tumorales adyacentes, y también se observaron diferentes patrones de Raman en diversos tejidos patológicos, lo que reflejaba la complejidad del metabolismo bioquímico en la progresión del cáncer de hígado51. Para confirmar las diferencias de estos componentes bioquímicos entre los tejidos con CHC y los tejidos adyacentes, se realizó un análisis metabolómico basado en LC-MS, que reveló que la mayoría de los metabolitos presentaban una tendencia a la baja en los tejidos con CHC, como la mayoría de los aminoácidos, lípidos y ácidos nucleicos, mientras que Aumentaron las PC etiquetadas con SFA o MUFA. El resultado fue consistente con el del análisis Raman, lo que demuestra que la metabolómica basada en Raman, también conocida como Ramanomics52, podría brindar información biológica completa y confiable como la metabolómica tradicional, y distinguir diferentes tejidos patológicos de manera más conveniente y rentable sin consumibles adicionales.

Además, se construyó un modelo CNN basado en VGG-16 y se empleó con éxito en la distinción entre espectros Raman recolectados de tejidos con carcinoma hepático y tejidos no tumorales adyacentes y el reconocimiento de diferentes tejidos patológicos hepáticos, incluidos diferentes subtipos, estadios tumorales y diferenciaciones. Los resultados demostraron que la espectroscopia Raman combinada con el aprendizaje profundo puede registrar e identificar con precisión patrones espectrales en diferentes muestras patológicas. Además, también planeamos estudiar la discriminación de precursores de HCC y lesiones hepáticas no malignas en el trabajo de seguimiento, así como la distinción entre cáncer de hígado primario y secundario, que es crucial para el tratamiento y pronóstico del carcinoma hepático.

En función de las diferencias espectrales de Raman, la morfología celular de los cortes de tejido se puede representar sin etiquetas. Las imágenes Raman resueltas por SMCR no solo podían mostrar distribuciones espaciales, sino también la identificación cuantitativa de los principales componentes bioquímicos (proteínas y lípidos) de células y tejidos a escalas subcelulares 2D y 3D, que no son aplicables mediante métodos estándar de tinción H&E. Esto indica que el análisis Raman subcelular tiene un gran potencial para simplificar el diagnóstico de cáncer durante los ensayos clínicos y proporciona una perspectiva sobre el diagnóstico histopatológico.

Clínicamente, la resección quirúrgica es un método estándar para el tratamiento del cáncer. La identificación precisa de los límites del tumor es útil para la resección completa de las lesiones sin una resección excesiva del tejido normal, especialmente para la resección de metástasis hepáticas. Sin embargo, esto suele ser un desafío para los cirujanos sin métodos intraoperatorios adecuados para distinguir visualmente los dos tejidos. Empleamos espectroscopía Raman en mediciones tanto ex vivo como in vivo para tejidos hepáticos caracterizados por diferentes patrones patológicos. Las imágenes adquiridas con distintos márgenes de cáncer eran visibles en función de las diferencias de espectro entre el tumor y las regiones del parénquima hepático. Además, verificamos con éxito la viabilidad del espectrómetro Raman portátil para distinguir tumores de regiones no tumorales durante la cirugía. Estos sugieren que la técnica Raman tiene el potencial de ayudar a los cirujanos a analizar rápidamente las regiones de interés durante la cirugía, sin interrupciones ni retrasos por cortes congelados intraoperatorios o tinción con H&E53.

Es de destacar que los espectros Raman de tejido recolectados por el espectrómetro Raman portátil difieren de los obtenidos con el espectrómetro micro-Raman, específicamente en algunas posiciones máximas (Fig. 13 complementaria). Esto puede atribuirse a las diferencias entre los dos tipos de equipos espectrales, como las fuentes de láser, la potencia y la longitud de onda del láser y el espectrómetro. También se observó un resultado similar en una detección Raman de tumores de ratón mediante un dispositivo Raman portátil54. Sin embargo, aunque hubo diferencias en los datos Raman medidos por los dos equipos, esto no afectó la capacidad de la espectroscopia Raman para discriminar los tejidos cancerosos de los normales adyacentes.

Además, la aplicación práctica de la espectroscopia Raman como herramienta clínica aún requiere una mayor exploración y optimización. En esta investigación, la señal Raman derivada de los bloques de tejido hepático es lo suficientemente alta como para ser detectada para el diagnóstico. Por lo tanto, no se requirieron nanopartículas metálicas para la mejora de la señal Raman, evitando el riesgo de toxicidad y excreción de partículas metálicas en aplicaciones clínicas55,56. Sin embargo, uno de los principales defectos de la espectroscopia Raman espontánea es la intensidad de la señal relativamente baja, lo que requiere un compromiso entre la calidad de la imagen y un tiempo de adquisición breve. Esto podría resolverse combinando la espectroscopia Raman coherente, que se basa en efectos ópticos no lineales y se puede utilizar simultáneamente para alta velocidad y alta resolución espacial en imágenes espectrales Raman48,57. Además, los puntos de recopilación espectral limitados con la sonda Raman portátil pueden provocar la pérdida de lesiones durante la cirugía, mientras que las fluctuaciones respiratorias pueden afectar la calidad espectral aunque el tiempo de integración Raman sea más de 10 veces más corto que el período respiratorio. Esperamos demostrar que un sistema de colaboración de robots inteligentes se puede utilizar para ayudar en la obtención de imágenes Raman intraoperatorias para resolver estos problemas en nuestro trabajo de seguimiento. Además, el desarrollo de equipos de diagnóstico portátiles integrados ha permitido la eliminación precisa de regiones de interés de una manera más conveniente durante la cirugía del cáncer58. Sin embargo, con la aparición de estos nuevos instrumentos, la estandarización de los instrumentos para todos los usuarios también es motivo de preocupación29, y deben estandarizarse factores como la longitud de onda de excitación, la potencia del láser, el tipo de colector de espectro, junto con los algoritmos de procesamiento de datos. Por lo tanto, se espera que pronto se desarrolle un sistema de espectroscopia Raman conveniente con un criterio de normalización para el diagnóstico preciso para facilitar su adopción clínica.

Aunque el trabajo actual se llevó a cabo en el contexto del carcinoma hepático, el mismo enfoque podría usarse para evaluar características histológicas similares de tumores en otros órganos. Por lo tanto, concluimos que la técnica Raman, junto con algoritmos inteligentes, podría aplicarse para el diagnóstico de tumores hepáticos y de otro tipo, desempeñando un papel potencial en la identificación patológica y la orientación intraoperatoria.

Todos los métodos de investigación actuales se llevaron a cabo según las pautas aprobadas por el Comité de Ética del Primer Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Wenzhou (Aprobación Ética No. 2020213). Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes para quienes se detallaron los riesgos y beneficios del ensayo.

En el presente estudio, se obtuvieron un total de 240 muestras de tejido con cáncer de hígado emparejado y bloques de tejido adyacente no tumoral de 120 pacientes con cáncer de hígado primario, de los cuales 98 individuos fueron diagnosticados con carcinoma hepatocelular (CHC) y 22 fueron colangiocarcinoma intrahepático. (ICC). En la Tabla complementaria 1 se proporciona información detallada sobre los diagnósticos clínicos e histopatológicos de los 120 pacientes. Los resultados del diagnóstico de los pacientes, incluido el tipo de cáncer, el estadio del cáncer y el tipo de diferenciación, fueron confirmados en base a indicadores clínicos y patológicos relacionados4 por médicos del primer hospital afiliado. de la Universidad Médica de Wenzhou.

Después de la resección e inspección quirúrgica, todas las muestras se almacenaron en un refrigerador a -80 °C. Antes de las mediciones espectrales, los bloques de tejido se colocaban en un portaobjetos de vidrio y el agua de la superficie del tejido se absorbía con papel de seda. Se aplicó un procesamiento de muestra mínimo para facilitar una mayor aplicación en la detección e imagen intraoperatorias. Los bloques de tejido recogidos de tejidos cancerosos y tejidos no tumorales adyacentes fueron reconfirmados por patólogos basándose en la tinción con H&E.

Para obtener imágenes de cortes de tejido, los cortes de tejido de 5 µm de espesor se prepararon usando un micrótomo de congelación y los cortes se unieron a portaobjetos de vidrio para mediciones Raman. El mismo tejido se observó mediante tinción con H&E después de las mediciones de Raman.

Los espectros Raman de las muestras de tejido se obtuvieron mediante un espectrómetro micro-Raman (Renishaw, Gloucestershire, Reino Unido) utilizando un láser de excitación a 532 nm. El rayo láser se enfocó sobre la superficie de la muestra mediante un objetivo Lx50 (apertura numérica (NA) = 0,50, la distancia de trabajo (WD) = 8,2 mm). Cada espectro se integró durante 3 s con una potencia de láser del 5 % (1,25 mW cm−2). Se recolectaron al menos 50 espectros en el rango de 500 a 2000 cm−1 de puntos seleccionados al azar en la superficie de cada muestra de tejido. Antes del análisis estadístico, los datos espectrales se procesaron con el software WIRE 5.3 con sustracción de línea base y suavizado Savitzky-Golay para eliminar el fondo de fluorescencia y aumentar la relación señal-ruido.

En las imágenes Raman de bloques de tejido para delinear el margen del tumor, los espectros Raman también se adquirieron con un objetivo L×50 (NA = 0,50, WD = 8,2 mm), equipado con un láser de 532 nm, con una potencia de láser de 2,5 mW cm−2 y 2 s tiempo de exposición para cada punto de datos. Los escaneos Raman se recolectaron con una resolución de 2 μm en las direcciones x e y (modo StreamHR), lo que permite una rápida recolección de espectros a alta resolución espacial. Para evitar comprometer la calidad del análisis Raman de gran aumento debido a las superficies irregulares de las muestras de tejido durante la obtención de imágenes, se utilizó la tecnología de seguimiento de enfoque LiveTrack para enfocar automáticamente la superficie de la muestra durante la adquisición de imágenes.

En las imágenes Raman de cortes de tejido, los espectros Raman se adquirieron a una resolución más alta de 0,8 μm en ambas direcciones axiales, con una potencia de láser de 12,5 mW cm−2 y un tiempo de exposición de 0,5 s para cada punto de datos. Los modos StreamHR y LiveTrack equipados con un láser de 532 nm y un objetivo L×50 (NA = 0,50, WD = 8,2 mm) se usaron como se indicó anteriormente para una adquisición de datos rápida y precisa.

Se utilizaron la resolución de la curva de automodelado (SMCR) y el análisis de conglomerados jerárquicos (HCA) del software WiRE 5.3 para el análisis de imágenes Raman de los márgenes tumorales. Los espectros se preprocesaron mediante la corrección de la línea de base, el suavizado, la eliminación de rayos cósmicos y el filtrado de ruido antes de cualquier otra imagen multivariante.

Se empleó un sistema de espectroscopia Raman portátil en la detección intraoperatoria del cáncer de hígado. Se empleó un láser de fibra acoplada a 785 nm (FC-D-785, Changchun New Industries Optoelectronics Technology Co., Ltd., China) como fuente de láser, que se introdujo en una sonda de mano conectada a una fibra de 100 µm para láser. excitación y una fibra estándar de 200 µm para la recogida de señales (NA = 0,22). Las señales Raman se recopilaron con un espectrómetro de fibra basado en un dispositivo de carga acoplada (CCD) (QE Pro, Ocean Optics Inc., Dunedin, FL, EE. UU.) en un rango espectral de 200 a 1100 nm y una resolución de 6 a 7 cm−1 . Los espectros cubrieron una amplia gama de cambios espectrales de 0 a 4000 cm−1. El espectrómetro se conectó a una PC mediante una interfaz OceanView.

Para evitar infecciones intraoperatorias, la sonda Raman y la fibra conectada se limpiaron con alcohol médico y se cubrieron con una funda protectora estéril desechable hecha de polietileno (Renhe Medical Supplies Industry and Trade Co., Ltd, Chun'an, China). Antes de la medición, la superficie del tejido se procesó para minimizar la sangre en el área analizada. Primero se registró un espectro de fondo y se restó automáticamente antes de cada medición utilizando un tiempo de integración de 0,2 s con el láser apagado. Luego se tomaron cinco medidas con un tiempo de integración de 0,2 s desde puntos seleccionados al azar de cada superficie de tejido. La potencia del láser en la punta de la sonda fue de aproximadamente 40–56 mW cm−2, medida con un medidor de potencia óptica (PM100D de Thorlabs Inc.). Los tejidos medidos fueron recogidos para biopsia de tejido por patólogos después de la cirugía.

En este estudio, se seleccionaron veinticinco pares de tejidos HCC coincidentes y tejidos no tumorales adyacentes para detectar diferencias metabólicas mediante LC-MS. Los métodos específicos de procesamiento y ensayo de muestras fueron los siguientes.

Se pesaron 25 mg de muestra en un tubo Eppendorf y se añadieron 500 μl de solución de extracto (metanol:acetonitrilo:agua = 2:2:1) y mezcla de patrón interno marcado isotópicamente. Luego, las muestras se homogeneizaron a 35 Hz durante 4 min y se sonicaron durante 5 min en un baño de agua con hielo. El ciclo de homogeneización y sonicación se repitió tres veces. Luego, las muestras se incubaron a -40 °C durante 1 h y luego se centrifugaron a 12 000 rpm durante 15 min a 4 °C. El sobrenadante resultante se transfirió a un vial de vidrio nuevo para su análisis. La muestra de control de calidad (QC) se preparó mezclando alícuotas iguales de los sobrenadantes de todas las muestras.

Los análisis LC-MS/MS se realizaron con un sistema UHPLC (Vanquish, Thermo Fisher Scientific) con una columna UPLC BEH Amide (2,1 mm × 100 mm, 1,7 μm) acoplada a un espectrómetro de masas Q Exactive HFX (Orbitrap MS, Thermo). La fase móvil consistió en acetato amónico 25 mmol/L e hidróxido amónico 25 mmol/L en agua (pH = 9,75) (A) y acetonitrilo (B). Se usó elución en gradiente: 0~0,5 min, 95% B; 0,5–7 min, 95%–65% B; 7–8 min, 65%–40% B; 8–9 min, 40% B; 9–9,1 min, 40%–95% B; 9,1–12 min, 95 % B. El caudal fue de 0,5 ml/min. La temperatura del automuestreador fue de 4 °C y el volumen de inyección fue de 2 μl.

El espectrómetro de masas QE HFX podría adquirir espectros MS/MS en modo de adquisición dependiente de la información en el control del software de adquisición (Xcalibur, Thermo). En este modo, el software de adquisición evalúa continuamente el espectro de MS. Las condiciones de la fuente ESI fueron las siguientes: tasa de flujo de gas envolvente, 30 Arb; Caudal de gas auxiliar, 25 Arb; temperatura capilar, 350 °C; resolución MS completa, 60.000; resolución MS/MS, 7500; energía de colisión, 30/10/60 en modo NCE; tensión de pulverización, +3,6 o −3,2 kV. La medición se logró con el apoyo de Shanghai Biotree Biotech Co., Ltd.

Los datos sin procesar se convirtieron al formato mzXML con ProteoWizard y se procesaron con un programa interno desarrollado con R y basado en XCMS para la detección, extracción, alineación e integración de picos. La identificación de los compuestos se basó en la relación masa-carga de los iones originales en la espectrometría de masas primaria y los iones de producto característicos generados por la fragmentación. Se utilizó una base de datos MS2 comercial (BiotreeDB) para anotar los metabolitos. El límite para la anotación se fijó en 0,6. Todos los iones detectados se normalizaron según estándares internos para su posterior análisis cuantitativo. Los iones detectados de ESI+ y ESI- se importaron al software SIMCA (Umetrics, Umea, Suecia) para el análisis multivariado. Para detectar metabolitos diferenciales entre HCC y tejidos no tumorales adyacentes, se seleccionaron iones con cambios significativos (prueba t de Student, P < 0,05), así como valores de importancia variable en el proyecto (VIP) > 1 en el modelo OPLS-DA . Finalmente, se identificaron y seleccionaron 57 metabolitos en modo ESI+ y 51 en modo ESI− como metabolitos diferenciales candidatos.

Los espectros Raman fueron analizados por PyTorch, y la arquitectura CNN fue modificada en base al marco VGG-1636. El modelo CNN se construyó con 13 capas convolucionales unidimensionales (incluidas 2 capas de convolución con 64 núcleos, 2 capas de convolución con 128 núcleos, 3 capas de convolución con 256 núcleos y 2 conjuntos de 3 capas de convolución con 512 núcleos), 5 agrupaciones capas (tamaño 2, zancada 2) y 3 capas completamente conectadas, como se ilustra en la Fig. 2h.

Para diferenciar los espectros de las áreas de tejido canceroso y paracanceroso, se utilizó un optimizador soft-max para transformar la salida de la capa de conexión anterior en una salida de probabilidad, con una tasa de aprendizaje de 0,0001 y un tamaño de lote de 128. Para evitar el sobreajuste, se La capa de abandono se empleó con una tasa del 50%, lo que anuló la contribución del 50% de las neuronas hacia la siguiente capa para reducir la dependencia excesiva de ciertas neuronas para la clasificación. Los datos espectrales de 20 pares de muestras de tejido hepático se seleccionaron aleatoriamente como conjunto de prueba, y los datos espectrales de los 100 pares de muestras restantes se dividieron aleatoriamente en un conjunto de entrenamiento y un conjunto de validación en una proporción de 8:2. Se realizaron divisiones similares en otros tres modelos de clasificación en los que el 20 % de las muestras de cada grupo se seleccionan aleatoriamente como conjunto de prueba, y las muestras restantes se dividen en el conjunto de entrenamiento y el conjunto de validación de acuerdo con la proporción de 9:1. Se utilizó el equilibrio de peso para aliviar posibles desequilibrios de datos al alterar el peso de cada muestra de entrenamiento al calcular la pérdida para que todas las clases contribuyan por igual a la pérdida (los detalles del código se pueden encontrar en el siguiente enlace de GitHub).

Python calculó los análisis de correlación de las intensidades máximas de Raman representativas basadas en el coeficiente de correlación de Pearson (r) en forma de un mapa de calor de matriz de correlación. La versión del software utilizado para analizar datos es la siguiente: Python 3.9.9, pytorch 1.10.1, numpy 1.22.0, matplotlib 3.5.1, torchvision 0.11.2, tqdm 4.62.3, pandas 1.0.4 y seaborn 0.9 .0.

Los datos se expresan como media ± desviación estándar (SD) como se indica en la leyenda de cada figura. Todos los datos se ajustaron a la distribución normal. La significación estadística entre los dos grupos se obtuvo mediante una prueba t de Student de dos colas con valores de P < 0,05 considerados significativos. Las micrografías de las imágenes de tinción y las imágenes Raman son representativas de tres mediciones independientes.

El algoritmo SMCR se utilizó en el análisis de imágenes Raman de cortes de tejido para identificar varios patrones histopatológicos hepáticos. El método SMCR es una forma de determinación de curvas multivariadas y análisis de mínimos cuadrados alternos, que transforma la información de los componentes en componentes físicamente significativos. Brevemente, SMCR descompone la matriz de datos experimentales (X), que contiene todos los datos espectrales de cada píxel, en dos matrices más pequeñas, la matriz de imágenes de concentración (C) y la matriz del espectro puro (S):

donde E es la matriz de error. Al estimar inicialmente la matriz de espectros, se pueden calcular S, C y ST, y luego se puede realizar una optimización iterativa utilizando el algoritmo alternativo de mínimos cuadrados (ALS) hasta que se alcance la convergencia59.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos que respaldan los resultados de este estudio están disponibles en el manuscrito y su información complementaria. Los datos de espectrometría de masas sin procesar asociados con este manuscrito se pueden encontrar en los Datos complementarios 1 y 2. Mientras que la base de datos comercial MS2 (BiotreeDB) debe obtenerse poniéndose en contacto con Biotree Biotech Co., Ltd. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

El código utilizado para el modelo de CNN y los conjuntos de datos de demostración están disponibles en https://github.com/thidoiSanren/CNN_liver-cancer_Raman60.

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Este trabajo fue apoyado financieramente por la Fundación Provincial de Ciencias Naturales de Zhejiang de China (Subvención No. LR19H180001) a YW, Leading Talent Innovation and Entrepreneurship Project de Wenzhou (RX2016005) a YW, y Public Projects of Wenzhou (2020005) a YW

Escuela de Ingeniería Biomédica, Escuela de Oftalmología y Optometría, Hospital Oftalmológico, Universidad Médica de Wenzhou, 325001, Wenzhou, PR China

Liping Huang, Liangbin Sun, Yuzhe Chen, Xueqian Ren, Yuancai Ge, Xiaohu Liu y Yi Wang

Centro de Investigación de Ingeniería de Materiales Funcionales Clínicos y Dispositivos de Diagnóstico y Tratamiento de la Provincia de Zhejiang, Instituto Wenzhou, Universidad de la Academia China de Ciencias, 325001, Wenzhou, PR China

Liping Huang, Danfeng Jiang, Qingwen Zhang y Yi Wang

El primer hospital afiliado de la Universidad Médica de Wenzhou, 325015, Wenzhou, PR China

Hongwei Sun y Keqing Shi

Instituto de Tecnología de Austria, Giefinggasse 4, Viena, 1210, Austria

Loma Wolfgang

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LH, QZ y YW diseñaron y realizaron el estudio. HS y KS proporcionaron muestras clínicas y asistieron en la tinción de tejidos y operaciones intraoperatorias. LS, YC y YG realizaron análisis estadísticos y establecieron los modelos CNN. XR y DJ ayudaron a LP con la preparación de tejidos y la prueba Raman. LP fue responsable del procesamiento de datos y gráficos. LH, XL y QZ escribieron el manuscrito. WK, QZ y YW supervisaron el proyecto. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Qingwen Zhang o Yi Wang.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Wei Min y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

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Reimpresiones y permisos

Huang, L., Sun, H., Sun, L. et al. Diagnóstico histopatológico rápido y sin etiquetas de cáncer de hígado basado en espectroscopia Raman y aprendizaje profundo. Nat Comun 14, 48 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-022-35696-2

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Recibido: 02 Marzo 2022

Aceptado: 15 de diciembre de 2022

Publicado: 04 enero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-35696-2

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