La formación de nanofibras como tecnología prometedora para la conservación y fácil almacenamiento de vesículas extracelulares

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 22012 (2022) Citar este artículo

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Las vesículas extracelulares (EV) son partículas encerradas en una membrana derivadas de células con el potencial para una amplia gama de futuras aplicaciones terapéuticas. Sin embargo, los EV casi siempre se han administrado mediante inyección directa, lo que probablemente obstaculice su eficacia debido a la rápida eliminación del sitio de inyección. El presente estudio tuvo como objetivo incorporar vesículas extracelulares de tamaño mediano (mEV) en nanofibras basadas en polivinilpirrolidona electrohiladas de disolución rápida para explorar la relación estructura-actividad dependiente del almacenamiento de las formulaciones nanofibrosas resultantes. Se seleccionaron soluciones precursoras acuosas basadas en polivinilpirrolidona para el proceso de electrohilado. La presencia de vehículos eléctricos en las muestras electrohiladas se confirmó mediante microscopía electrónica de transmisión, citometría de flujo y microscopio de barrido láser confocal. Los resultados indican que la estructura fibrosa de las muestras se conservó hasta el final del período de almacenamiento de 12 semanas. Además, independientemente de la temperatura de almacenamiento (4 °C o temperatura ambiente), las nanofibras y los vehículos eléctricos asociados a nanofibras estuvieron presentes durante todo el período experimental. La incorporación de vehículos eléctricos en una base polimérica sólida estable podría preservar su estabilidad; mientras tanto, de acuerdo a las características del polímero, se puede lograr su liberación dirigida y controlada.

Las vesículas extracelulares (EV) son pequeñas vesículas delimitadas por bicapa lipídica que difieren en tamaño y biogénesis, se liberan naturalmente de cuerpos multivesiculares/anfisomas o la membrana plasmática y luego ingresan a los fluidos corporales1. Además de su papel fisiológico en la homeostasis celular, la comunicación intercelular y la respuesta inmunitaria como transportadores biocompatibles naturales de sustancias bioactivas, el interés reciente se ha centrado en su uso como medio de administración de fármacos2,3. Los EV pueden permitir la internalización eficiente de fármacos encapsulados en vesículas4,5. Los EV pueden ser absorbidos por las células receptoras, lo que permite su aplicación como terapia primaria o como vehículo de administración de fármacos.

Los EV derivados de células madre mesenquimales (MSC-EV) han mostrado un potencial prometedor en la regeneración de tejidos. Sin embargo, su potencial terapéutico está limitado por su rápido agotamiento y su corta vida media6. Se han descrito varios enfoques para la incorporación exógena de fármacos en vehículos eléctricos aislados, que van desde la incubación simple, moléculas lipofílicas o técnicas de carga activa de compuestos hidrofobizados, como congelación-descongelación repetida y permeabilización con saponina, extrusión, ultrasonicación y electroporación7. Las moléculas encapsuladas en los vehículos eléctricos pueden ser sustancias biológicas funcionalmente activas, incluidas proteínas, ARNm y miARN, capaces de transmitir señales a las células diana circundantes, así como a órganos distantes a través de vasos sanguíneos y linfáticos8. La complejidad estructural de los productos biológicos también puede plantear desafíos adicionales de formulación y administración, especialmente en lo que respecta a la estabilidad. Para llegar al tejido objetivo, EV se puede administrar por diferentes vías, como intravenosa, intraperitoneal, oral, intranasal y subcutánea. Sin embargo, los vehículos eléctricos casi siempre se han administrado como inyecciones directas, lo que probablemente inhiba su eficacia debido al rápido flujo de salida del lugar de la inyección9. Para minimizar la acción tóxica de los vehículos eléctricos en órganos no objetivo y maximizar los efectos terapéuticos previstos, los vehículos eléctricos aislados deben incorporarse a biomateriales que puedan controlar su liberación.

Los EV se pueden separar del medio acondicionado de cultivos celulares. En cuanto al almacenamiento del medio acondicionado, la Sociedad Internacional de Vesículas Extracelulares recomienda (MISEV2018) el almacenamiento de las EV en solución salina tamponada con fosfato a -80 °C en recipientes siliconizados para evitar la adherencia de las EV a las superficies10 a -80 °C.

Recientemente, PBS que contiene HEPES, albúmina de suero humano y trehalosa11. Sin embargo, el uso de esta condición de almacenamiento puede estar limitado por los desafíos de costo y transporte.

Por lo tanto, se necesitan soluciones alternativas para mejorar la estabilidad de almacenamiento de EVs12. Según algunos estudios previos13,14, se puede concluir que la incorporación de vehículos eléctricos en nanofibras podría ser una buena solución para superar sus problemas de estabilidad. Se ha demostrado que las células siguen siendo viables después del electrohilado, y las fibras llenas de células resultantes se pueden usar para una variedad de aplicaciones terapéuticas. Trindade et al.15 desarrollaron andamios de disolución rápida para permitir una evaluación rápida de la carga EV. Descubrieron que la elección del solvente es especialmente relevante cuando se procesa material biológico en electrohilado de un solo fluido. Se utilizó trifluoroetanol en lugar de etanol, ya que es un disolvente más suave en las muestras biológicas16. El electrohilado es una tecnología rápida, rentable, escalable y a temperatura ambiente que puede formar estructuras nanofibrosas complejas y es una buena opción para la formulación de activos sensibles.

En nuestro proyecto, como base de la formulación nanofibrosa electrohilada se eligió polivinilpirrolidona (PVP). El PVP es un polímero inerte, no tóxico y biocompatible, lo que lo convierte en un excipiente versátil tanto para formulaciones convencionales como para nuevos sistemas de administración dirigida o controlada, que actúa como aglutinante, agente de recubrimiento, agente de suspensión, formador de poros, solubilizante, estabilizador, etc. La PVP con diferentes pesos moleculares y concentraciones se usa en una variedad de formulaciones para diferentes propósitos. Debido a la solubilidad en agua, la hidrofilicidad y la capacidad de formación de enlaces de hidrógeno, puede mejorar la biodisponibilidad y la estabilidad de los ingredientes farmacéuticos activos, puede mejorar la estabilidad fisicoquímica de las preparaciones, puede ajustar la velocidad de liberación de los medicamentos y puede prolongar la vida in vivo. tiempo de circulación de los liposomas17,18.

Las muestras nanofibrosas que contienen mEV se pueden disolver ex tempore, por lo que la buena propiedad soluble en agua de la matriz es esencial. Además, el PVP es una buena opción para el proceso de formación de fibras ya que también tiene una excelente propiedad de electrohilado19,20,21,22. Se necesita una solución isotónica para preservar la estructura de los vehículos eléctricos, pero la tensión superficial de la solución aumenta, lo que dificulta el proceso estable de formación de fibras. Hay otros polímeros hidrofílicos biocompatibles, por ejemplo, derivados de celulosa, que también se usan comúnmente en formulaciones farmacéuticas, pero la formación de fibras a partir de sus soluciones acuosas es difícil, y mucho menos a partir de sus soluciones isotónicas23,24,25. Sin embargo, las nanofibras de celulosa forman naturalmente redes nanoporosas; por lo tanto, potencialmente puede atrapar vehículos eléctricos de tamaño nanométrico cerca del tamaño del poro de la nanofibra de celulosa. Además, las diferentes interacciones químicas, como los enlaces de hidrógeno, las fuerzas electrostáticas u otras interacciones específicas, podrían mejorar la eficiencia del aislamiento26.

La mayor comprensión de cómo almacenar mejor los EV terapéuticos aislados y procesados ​​permitiría que los enfoques basados ​​en EV alcancen todo su potencial versátil como una nueva clase de terapias prometedoras y portadores de fármacos. Por lo tanto, el presente trabajo tiene como objetivo investigar la incorporación de EV en nanofibras basadas en PVP electrohiladas de rápida disolución biodegradables preparadas a partir de una solución precursora acuosa y explorar la relación estructura-actividad dependiente del almacenamiento de las formulaciones nanofibrosas resultantes. Nuestra caracterización de las formulaciones nanofibrosas incluyó la evaluación de la morfología, las propiedades fisicoquímicas y la estabilidad durante el almacenamiento.

Como base de la formulación se eligió el polímero polivinilpirrolidona (PVP, Kollidon K90, de peso molecular promedio, Mw ~ 1 500 000 g mol−1) biodegradable, biocompatible y bien electrohilable (Merck Ltd, Budapest, Hungría). Polysorbate 80 (Molar Chemicals Ltd., Budapest , Hungría) para disminuir la tensión superficial de la solución y mejorar la capacidad de formación de fibras de la solución precursora isotónica. El cloruro de sodio (Molar Chemicals, Budapest, Hungría) se utilizó para la isotonización de la solución precursora basada en PVP utilizada para el proceso de formación de fibra Para la preparación de la solución se utilizó agua destilada de grado farmacopeico sin purificación adicional.

Charles Lai y Xandra Breakefield proporcionaron amablemente la línea celular HEK293T-palmGFP. Las células HEK293T-palmGFP se cultivaron en DMEM que contenía suero fetal bovino (FBS) al 10% (v/v), 1000 U/L de penicilina, 1000 U/L de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina y 1 g/L de glucosa. Las células se mantuvieron a 37 °C en una atmósfera humidificada al 5 % (v/v) de CO2. Se controló el estado de infección por Mycoplasma del cultivo celular. El medio acondicionado se recogió 24 h después de la privación de FBS de ocho matraces de superficie tratada de 182,5 cm2 (VWR, EE. UU.). El número de pases osciló entre 16 y 22 y el cultivo celular alcanzó una confluencia del 80 al 90 %, lo que representa 179 × 106 ± 69,3 × 106 células por separación. Durante la separación EV, la viabilidad celular se determinó mediante tinción con azul de tripano y citometría de flujo, tinción con TO-PRO-3 y anexina V. Durante la separación EV, el medio acondicionado se centrifugó a 300 g a 4 °C durante 10 min y se filtró. con un filtro celular de 5 μm (Millipore, EE. UU.). Los Evs de gran tamaño se retiraron a 2000 g a 4 °C durante 30 min. Los mEV se separaron del sobrenadante a 12 500 g a 4 °C durante 40 min. El sedimento de mEV se lavó una vez con NaCl-HEPES (10 mM, 12500 g, 4 °C, 40 min). El sedimento de mEV se resuspendió en 100 µl de NaCl-HEPES (10 mM). Se usaron 50 µL (1,6 × 109 ± 6,7 × 108 partículas) para formar nanofibras de PVP que contenían mEV (PVP-mEV), se usaron 42 µL (1,3 × 109 ± 5,6 × 108 partículas) para generar muestras de control mEV libres y 8 Se utilizó µL para caracterizar la fracción mEV. La presencia de mEV se confirmó mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM), citometría de flujo, análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA), cuantificación de proteínas y lípidos. Los parámetros detallados de los pasos de centrifugación se resumen en la Tabla S1.

La morfología de Evs fue examinada por microscopía electrónica de transmisión (TEM). Las muestras se prepararon con modificaciones menores basadas en el trabajo de Théry y colegas27. Brevemente, 2–3 µL de la muestra se colocaron en una rejilla recubierta de formvar (Sigma, EE. UU.) y se incubaron durante 10 min a temperatura ambiente (RT). Se eliminó la solución residual y se fijó con glutaraldehído al 2% durante 10 min. Las rejillas se lavaron tres veces durante 5 min y luego se aumentó el contraste con oxalato de uranilo. Las muestras se contrastaron adicionalmente y se incluyeron en una mezcla de 4 % (p/v) de acetato de uranilo y 2 % (p/v) de metilcelulosa. Las muestras se analizaron con JEOL 1011 TEM (JEOL Ltd., Tokio, Japón).

La distribución de tamaños, el tamaño medio y la concentración de partículas de los mEV se determinaron mediante NTA. La medición se realizó con un ZetaView PMX-120 (Particle Metrix GmbH, Meerbusch, Alemania) utilizando el software ZetaVIEW. Los parámetros de la medición se resumen en la Tabla complementaria 2. El NTA no fue adecuado para la caracterización de mEV incrustados en fibras de PVP, porque la cantidad de partículas detectadas aumentó significativamente después de la disolución de las fibras de PVP puras (Fig. S1).

La concentración de proteína se determinó mediante un ensayo Micro BCA (ThermoFisher, EE. UU.) para el cual se prepararon muestras EV mediante 3–4 ciclos de congelación y descongelación y sonicación (10 min, 4 °C). El contenido de lípidos se midió mediante el ensayo de lípidos de sulfofosfovainillina optimizado por Visnovitz et al., 201928.

Los mEV se caracterizaron con el citómetro de flujo CytoFLEX S (Beckman Coulter, EE. UU.) en función de la detección de GFP, AnnexinV, CD81 y CD63. Los mEV se diluyeron en tampón de unión a anexina (AxBB, HEPES 10 mM, NaCl 0,14 M, CaCl2 2,5 mM) que contenía anexina V conjugada con fluorocromo o anticuerpos. Se utilizaron los siguientes reactivos: AnnexinV-AF647 (1:200, Sony Biotechnology, EE. UU.), monoclonal antihumano CD81-PerCP-Cy5.5 (1:200, isotipo: mouse IgG1, clon: 5A6, Sony Biotechnology, EE. UU.) , CD63-PerCP-Cy5.5 monoclonal antihumano (1:200, isotipo: IgG1 de ratón, clon: H5C6, Sony Biotechnology, EE. UU.), IgG1-PerCP-Cy5.5 monoclonal de ratón (1:200, clon: MOPC21, Sony Biotechnology, EE.UU.). Después de 15 min de incubación, las muestras se analizaron durante un minuto a un caudal medio (30 µL/minuto). La presencia de mEV se confirmó mediante lisis Triton X-100 (0,1%, Molar Chemicals Kft., Budapest, Hungría). Los datos sin procesar se procesaron con el software FlowJo-V10. Todos los anticuerpos utilizados en este experimento se enumeran en la Tabla S3.

Las soluciones acuosas de precursor de polímero de PVP puras y cargadas con mEV al 15 % (p/p) se hicieron isotónicas con NaCl y se usaron para el proceso de formación de fibras. Para mejorar la capacidad de formación de fibras del aumento de la conductividad y la tensión superficial de las soluciones isotónicas, se añadió polisorbato 80 al 1% (p/p).

Se usó un dispositivo de electrohilado del tamaño de un laboratorio (SpinSplit Ltd., Budapest, Hungría) para preparar las muestras fibrosas. Las soluciones precursoras homogéneas colocadas en una jeringa de plástico (jeringa Luer lock, Merck Ltd., Budapest, Hungría) se conectaron a un emisor convencional (22 G) con un tubo de teflón. La bomba de jeringa proporcionó el caudal continuo de la solución precursora. El voltaje aplicado fue de 22 a 23 kV, la distancia emisor-colector fue de 20 cm y el caudal fue de 0,08 μL/seg durante el proceso de formación de fibras. Los experimentos de electrospinning se realizaron en una habitación bien templada con una temperatura de 22 ± 1 °C y 40 ± 5% de humedad.

El análisis morfológico de las muestras electrohiladas se realizó con un microscopio electrónico de barrido (SEM) tipo JEOL JSM-6380LA (JEOL Ltd., Tokio, Japón), después de pulverizar con oro. Las mediciones se realizaron a un voltaje de aceleración de 15 kV y una distancia de muestra de 10 mm. Las muestras formadas en el papel de aluminio se unieron a lingotes de cobre con adhesivo de carbono de doble cara y luego se examinaron después del dorado con múltiples aumentos. Los diámetros de fibra se midieron con el software ImageJ (Institutos Nacionales de Salud de EE. UU., Bethesda, MD, EE. UU.) y el diámetro de fibra promedio se calculó en base a 100 fibras individuales diferentes seleccionadas al azar con un aumento de 3500 ×.

La estabilidad de los mEV libres y PVP-mEV mantenidos a 4 °C o temperatura ambiente se controló dos veces por semana durante 12 semanas con un citómetro de flujo. Los nanotubos de PVP-mEV se retiraron de la superficie de la lámina de aluminio con una espátula y se midió la masa en un tubo Eppendorf con una balanza analítica. Los nanotubos de PVP-mEV se disolvieron en AxBB (33,9 ± 3,7 µL AxBB/ 1 mg de PVP-mEV). Se usaron nanofibras de PVP en blanco como controles. Las muestras de PVP, PVP-mEV y mEV libre se diluyeron diez veces en anticuerpo o solución de AxBB que contenía anexina V. Anexina V-AF647 (1:200, Sony Biotechnology, EE. UU.), monoclonal antihumano CD81-PerCP-Cy5.5 (1:200, isotipo: ratón IgG1, clon: 5A6, Sony Biotechnology, EE. UU.), monoclonal ratón IgG1- Se utilizaron PerCP-Cy5.5 (1:200, clon: MOPC21, Sony Biotechnology, EE. UU.). Después de 15 min de incubación, las muestras se diluyeron cinco veces y se midieron con un citómetro de flujo CytoFLEX S (Beckman Coulter, EE. UU.) durante un minuto a un caudal medio (30 µl/minuto). Se usaron perlas de conteo a una dilución de 20 veces (Count Check Beads-High, 2,436 × 105 perlas/mL, Sysmex, Alemania) para determinar el número de mEV según la siguiente ecuación:

La integridad de los mEV se comprobó mediante lisis con TritonX-100 (0,1%). Se utilizó el software FlowJo-V10 para analizar los datos sin procesar. Todos los anticuerpos utilizados en este experimento se enumeran en la Tabla S3.

La estabilidad de las muestras de PVP-mEV mantenidas a 4 °C o temperatura ambiente se controló cuatro veces por semana durante 12 semanas utilizando un microscopio de barrido láser confocal. Los nanotubos de PVP-mEV estaban disponibles en cubreobjetos de 24 × 32 mm (VWR, EE. UU.). Los cubreobjetos se examinaron con un microscopio de barrido láser confocal Leica TCS SP8 (Leica, Alemania). La disposición inversa del microscopio nos permitió detectar la presencia de mEV asociados a nanotubos a alta resolución (se utilizó aceite de inmersión en la parte inferior y superior). Las muestras se analizaron con los mismos ajustes: 63 × objetivo, 0,9 % de potencia de láser (488 nm), índice de refracción: 1,516, promedio de 16 líneas, resolución de 3064 × 3064. La señal de fluorescencia de GFP fue detectada por un detector híbrido con luz visible a 300 V PMT.

Los valores se muestran como media ± error estándar. El análisis estadístico y las cifras se prepararon utilizando el software GraphPad Prism 7.00 (EE. UU.). Se usaron ANOVA de dos vías y pruebas posthoc de Tukey para comparar los datos. Se aceptó como estadísticamente significativo un valor de p inferior a 0,05.

Los mEV se separaron del medio acondicionado de las células HEK293T-palmGFP. La viabilidad celular fue del 93,3 ± 0,9% (con tinción con azul de tripano). Según las mediciones de citometría de flujo, la proporción de células apoptóticas (AnnexinV+) y necróticas secundarias (AnnexinV+, TO-PRO-3+) fue de 3,9 ± 2,0 % y 5,8 ± 2,1 %, respectivamente (Fig. 1A). La distribución de tamaño de los mEV se determinó mediante NTA (Fig. 1B), según la cual su tamaño medio fue de 332,4 ± 25,7 nm (Fig. 1C). El número de partículas fue de 1,7 × 106 ± 2,2 × 105/105 células (Fig. 1D). La relación proteína/lípido de los mEV fue de 3,0 ± 2,5 (Fig. 1E). Según las mediciones de citometría de flujo, los mEV fueron GFP, AnnexinV, CD81 y CD63 positivos y sensibles a la lisis Triton X-100 (Fig. 1F).

Caracterización de mEV libres derivados de HEK293T-palmGFP. La viabilidad de las células se analizó por citometría de flujo (A). Determinamos la distribución de tamaño (B), el tamaño medio (C) y la concentración de partículas (D) de mEV mediante análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA). Cuantificamos las vesículas en función de su contenido de proteínas y lípidos (E). La presencia de GFP, fosfatidil-serina externalizada (teñida con Anexina V), CD81 y CD63 se detectaron por citometría de flujo (F). (AB: tinción específica de antígeno con anticuerpo, Tx: Triton X-100, IC: control de isotipo) (La figura se preparó con GraphPad Prism 7.00 para Windows, GraphPad Software, San Diego, California, EE. UU., http://www.graphpad. com).

La caracterización morfológica de las muestras electrohiladas se realizó por SEM. La imagen muestra que la adición de vesículas a la solución precursora no tiene efecto negativo en la formación de fibras (Fig. 2A) se obtuvo una estructura claramente fibrosa de 465 nm ± 62 nm de diámetro promedio de fibra ± desviación estándar con una distribución aparentemente normal (Fig. 2B). La superficie de las fibras es suave, lo que indica que tanto los parámetros de producción de fibra como de solución eran apropiados para la producción de fibra.

Imagen SEM de la muestra electrohilada preparada a partir de soluciones precursoras basadas en PVP que contienen vesículas extracelulares de tamaño medio (mEV) (aumento: 2500x) (A) y distribución del diámetro de fibra de la muestra (B).

Las muestras libres de mEV y PVP-mEV se caracterizaron mediante citometría de flujo, microscopía de escaneo láser confocal y TEM (Fig. 3A-C). En comparación con los mEV libres, la intensidad de fluorescencia media (MFI) de GFP de los PVP-mEV disminuyó y aumentó la desviación estándar de la distribución de tamaño basada en el valor Violet-SSC. Si bien los mEV libres fueron sensibles a la lisis de Triton X-100, el número de PVP-mEV no cambió significativamente. Con respecto al marcador CD81 EV, mEV libre mostró un valor de MFI más alto en comparación con PVP-mEV. Los mEV libres mostraron positividad para anexina V. Por el contrario, los PVP-mEV fueron negativos para Anexina V (Fig. 3A).

Comparación de mEV libres y fibras PVP cargadas con mEV (PVP-mEV). Los mEV libres y los PVP-mEV se compararon mediante citometría de flujo basada en la señal GFP, la lisis TritonX-100, CD81 y marcadores de fosfatidilserina (AnnexinV) (A). Los mEV se detectaron en función de la fluorescencia de GFP, mientras que las nanofibras se detectaron con luz visible utilizando un microscopio de barrido láser confocal (B). La presencia y la morfología de los mEV se confirmaron mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) (C). (AB: tinción específica de antígeno con anticuerpo, Tx: Triton X-100).

La presencia de mEV se detectó mediante microscopía de barrido láser confocal. En ambas muestras, su presencia se detectó con éxito en función de la señal de fluorescencia de GFP. En el caso de muestras de PVP-mEV, se puede ver que los mEV están presentes en una forma asociada a nanofibras (Fig. 3B). La morfología de mEV libres y PVP-mEV después de la disolución se caracterizó por TEM. Pudimos identificar mEV en ambas muestras (Fig. 3C).

La diferencia observada entre las muestras mEV libre y PVP-mEV puede explicarse por el hecho de que la PVP puede adherirse a la superficie de las nanopartículas basadas en lípidos a través de enlaces de hidrógeno29. Forma una capa protectora macromolecular que brinda estabilidad a las nanopartículas y puede proteger contra la agregación30. La PVP puede reducir la unión de proteínas a los liposomas debido a su neutralidad eléctrica31. Dado que los liposomas y los EV se comportan de manera similar en muchos aspectos, asumimos que se puede formar un caparazón de PVP alrededor de los mEV. Debido a la presencia de la cubierta de PVP, puede disminuir la accesibilidad de CD81 y fosfatidilserina a anticuerpos y anexina V. A medida que la PVP aumenta la estabilidad de los mEV, tienen una menor sensibilidad a la lisis TritonX-100.

La estabilidad de PVP-mEV y mEV libres mantenidos a 4 °C o temperatura ambiente se controló durante 12 semanas. Las muestras se analizaron cada dos semanas mediante un citómetro de flujo en función de los parámetros GFP, Violet-SSC, CD81 y el número de partículas. Los valores medianos de GFP MFI y Violet-SSC de mEV libres aumentaron (Fig. 4A, B). Paralelamente, el MFI relativo de CD81 disminuyó significativamente ya en la semana 2. Esta tendencia fue más pronunciada para las muestras mantenidas a temperatura ambiente (Fig. 4C). Independientemente de la temperatura, el número calculado de partículas disminuyó después de 2 semanas y se mantuvo bajo durante todo el experimento (Fig. 4D). Los mEV unidos a las nanofibras de PVP se mantuvieron estables durante 12 semanas según el valor medio de Violet-SSC, GFP MFI y el número de partículas (Fig. 4A, B, D). El MFI relativo de CD81 de las muestras mantenidas a temperatura ambiente disminuyó significativamente después de 6 semanas, mientras que las muestras a 4 °C permanecieron estables (Fig. 4C). El valor relativo de MFI de los controles de isotipo CD81 se mantuvo bajo durante la duración del experimento (Fig. S2). Además de los valores medianos, también determinamos el valor robusto del coeficiente de variación (rCV) de las curvas de distribución (Fig. S3). Con respecto a los mEV libres, vimos un ligero aumento en los tres parámetros. En el caso de PVP-mEV, vimos una tendencia creciente para el marcador CD81 en las muestras de RT. En función de la interacción de enlace H similar descrita dentro de PVP y la superficie del liposoma, las fibras de PVP pueden formar una capa protectora macromolecular que brinda estabilidad a las nanopartículas y puede proteger contra la agregación (Fig. 4E). Además, la PVP puede reducir la unión de proteínas a los liposomas debido a su neutralidad eléctrica. Dado que los liposomas y los vehículos eléctricos se comportan de manera similar en muchos sentidos, asumimos que se puede formar un caparazón de PVP alrededor de los vehículos eléctricos de tamaño mediano. Debido a la presencia de la cubierta de PVP, puede disminuir la accesibilidad de CD81 y fosfatidilserina a anticuerpos y anexina V. Como PVP aumenta la estabilidad de los vehículos eléctricos de tamaño mediano, tienen una menor sensibilidad a la lisis TritonX-100.

Investigación de estabilidad de fibras de PVP cargadas con mEV y mEV libres (PVP-mEV) mediante citometría de flujo. La estabilidad de los mEV libres y PVP-mEV mantenidos a 4 °C o temperatura ambiente se controló durante 12 semanas, cada dos semanas mediante citometría de flujo. La estabilidad se investigó en función de la señal de GFP unida a la membrana de los mEV (A), el parámetro Violet-SSC que se correlaciona con el tamaño de la vesícula (B), la expresión de CD81 (C) y el número de partículas (D). Las ilustraciones esquemáticas del mecanismo hipotético de los cambios observados para las muestras libres de mEV y PVP-mEV mantenidas a 4 °C se resumen en el panel (E). nmEV-GFP = 3, nViolet-SSC = 3, nCD81 = 3, nnúmero de partículas = 2 (La figura se preparó con GraphPad Prism 7.00 para Windows, GraphPad Software, San Diego, California, EE. UU., http://www.graphpad.com) .

La estabilidad de las muestras fibrosas de PVP-mEV mantenidas a 4 °C o temperatura ambiente se controló cada cuatro semanas durante 12 semanas utilizando un microscopio de barrido láser confocal (semanas 0, 4, 8 y 12). Las nanofibras de PVP se detectaron con luz visible, mientras que los EV se detectaron por su fluorescencia GFP. Se puede ver claramente en la Fig. 5 que la estructura fibrosa de la muestra permaneció visible hasta el final del período de almacenamiento de 12 semanas, además, independientemente de la temperatura (4 °C o TA), las nanofibras y las GFP asociadas a las nanofibras Los mEV positivos estuvieron presentes durante todo el experimento.

Investigación de la estabilidad de las fibras PVP cargadas con mEV (PVP-mEV) mediante microscopio de barrido láser confocal. La estabilidad de los PVP-mEV mantenidos a 4 °C o temperatura ambiente se controló durante 12 semanas, cada cuatro semanas mediante un microscopio de barrido láser confocal.

La condición de almacenamiento más prometedora para los vehículos eléctricos es −80 °C; sin embargo, esta condición puede verse limitada por los desafíos de costo y transporte. Una técnica alternativa de conservación de EV es la liofilización, pero es costosa y su reproducibilidad plantea dudas. Electrospinning ofrece una buena solución alternativa para mejorar la estabilidad de almacenamiento de vesículas. Esta tecnología rápida, rentable, escalable y a temperatura ambiente puede formar estructuras nanofibrosas complejas y crear una plataforma tecnológica, lo que la convierte en una herramienta viable para formular medicamentos sensibles. La incorporación de vehículos eléctricos en nanofibras permite el almacenamiento de vesículas en fase sólida que conserva la estabilidad, lo que abre nuevos horizontes en la investigación de aplicaciones terapéuticas.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado [y sus archivos de información complementarios].

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Esta investigación fue apoyada por el Fondo de Ciencia e Innovación Semmelweis (STIA-KF-2021) y el Proyecto Nacional de Laboratorio Cardiovascular, Hungría. El proyecto también ha recibido financiación del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la UE en virtud del acuerdo de subvención n.º 739593.

Estos autores contribuyeron por igual: Krisztina Németh y Adrienn Kazsoki.

Departamento de Genética Celular e Inmunobiología, Universidad Semmelweis, Nagyvárad Square 4, Budapest, 1089, Hungría

Krisztina Németh, Tamás Visnovitz & Edit I. Buzás

ELKH-SE Grupo de Investigación de Vesículas Extracelulares Traslacionales, Budapest, Hungría

Krisztina Németh & Edit I. Buzás

Farmacia Universitaria Departamento de Administración Farmacéutica, Universidad Semmelweis, Hőgyes Endre Street 7-9, Budapest, 1092, Hungría

Adrienn Kazsoki y Romána Zelkó

Departamento de Fisiología Vegetal y Biología Molecular de Plantas, Universidad Eötvös Loránd, Pázmány Péter Sétány 1/C, Budapest, 1117, Hungría

Tamás Visnovitz

Departamento de Ingeniería de Polímeros, Facultad de Ingeniería Mecánica, Universidad de Tecnología y Economía de Budapest, Műegyetem Rkp. 3, Budapest, 1111, Hungría

Balázs Pinke & László Mészáros

ELKH-BME Grupo de Investigación de Ciencia y Tecnología de Compuestos, Universidad Tecnológica Rkp. 3, Budapest, 1111, Hungría

László Mészáros

Grupo de Investigación de Vesículas Extracelulares HCEMM-SU, Budapest, Hungría

Edith I. Buzas

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RZ y EIB: conceptualización, KN, AK, TV y BP: metodología, KN, AK y LM: análisis formal, investigación: KN y AK, redacción, preparación del borrador original: KN y AK; escritura—revisión y edición—EIB, RZ y LM, visualización—AK y KN; supervisión—RZ, BEI

Correspondencia a Edit I. Buzás o Romána Zelkó.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Németh, K., Kazsoki, A., Visnovitz, T. et al. La formación de nanofibras como una tecnología prometedora para la conservación y fácil almacenamiento de vesículas extracelulares. Informe científico 12, 22012 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-25916-6

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Recibido: 27 de septiembre de 2022

Aceptado: 07 diciembre 2022

Publicado: 20 diciembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-25916-6

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