La criopreservación de islotes pancreáticos por vitrificación logra alta viabilidad, función, recuperación y escalabilidad clínica para trasplante

Nature Medicine volumen 28, páginas 798–808 (2022)Citar este artículo

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El trasplante de islotes pancreáticos puede curar la diabetes, pero requiere islotes accesibles y de alta calidad en cantidades suficientes. La crioconservación podría resolver los desafíos de la cadena de suministro de los islotes al permitir el almacenamiento y la agrupación de islotes donantes con control de calidad. Desafortunadamente, la crioconservación no ha tenido éxito en este objetivo, ya que debe proporcionar simultáneamente una alta recuperación, viabilidad, función y escalabilidad. Aquí, logramos este objetivo en islotes de células beta (SC-beta) derivadas de células madre humanas, porcinas, humanas y de ratón mediante la optimización integral de la composición del agente crioprotector (CPA), las condiciones de carga y descarga de CPA y los métodos para vitrificación y recalentamiento (VR). La viabilidad de los islotes posterior a la VR, en relación con el control, fue del 90,5 % para ratones, 92,1 % para SC-beta, 87,2 % para porcinos y 87,4 % para islotes humanos, y permaneció sin cambios durante al menos 9 meses de almacenamiento criogénico. Los islotes VR tenían una morfología macroscópica, microscópica y ultraestructural normal. El potencial de membrana mitocondrial y los niveles de trifosfato de adenosina (ATP) se redujeron ligeramente, pero todas las demás medidas de la respiración celular, incluida la tasa de consumo de oxígeno (OCR) para producir ATP, permanecieron sin cambios. Los islotes VR tenían una función normal de secreción de insulina estimulada por glucosa (GSIS) in vitro e in vivo. Los islotes porcinos y SC-beta produjeron insulina en modelos de xenotrasplante, y los islotes de ratón probados en un modelo de trasplante singénico de masa marginal curaron la diabetes en el 92 % de los receptores dentro de las 24–48 h posteriores al trasplante. Se observó un excelente control glucémico durante 150 días. Finalmente, nuestro enfoque procesó 2500 islotes con > 95 % de recuperación de islotes a > 89 % de viabilidad posterior a la descongelación y puede ampliarse fácilmente para obtener un mayor rendimiento. Estos resultados sugieren que la crioconservación ahora se puede utilizar para suministrar los islotes necesarios para mejorar los resultados de los trasplantes que curan la diabetes.

A pesar de 100 años de desarrollo terapéutico desde el descubrimiento de la insulina, las terapias actuales para la diabetes, como los monitores continuos de glucosa, las bombas de insulina y los sistemas de circuito cerrado, siguen siendo un tratamiento para la afección en lugar de una cura para la enfermedad1. Aunque las últimas décadas han visto un progreso sustancial en el desarrollo del trasplante de islotes como una cura potencial para la diabetes2, una de las principales limitaciones de este enfoque es que los trasplantes de un solo donante a menudo son insuficientes para lograr la independencia de la insulina en el receptor3,4. Con frecuencia, se requieren dos, tres o más infusiones de islotes de donantes por un total de 700 000 a >1 M de equivalentes de islotes (IEQ) para un receptor "típico" de 70 kg5,6, lo que agrega riesgos asociados con intervenciones quirúrgicas repetidas y múltiples rondas de inducción de inmunosupresión fuerte.

Una estrategia para superar el problema del suministro de donantes es agrupar islotes de múltiples donantes, logrando una dosis alta de islotes con una sola infusión7,8, aumentando la eficacia y reduciendo el riesgo. Aunque varios grupos han demostrado la viabilidad de cultivar islotes durante períodos prolongados (semanas a meses)9, la mayoría ha notificado una recuperación reducida de los islotes y pérdida de la función endocrina con el tiempo10,11. Por lo tanto, los grandes ensayos clínicos suelen limitar el cultivo a 48-72 h antes del trasplante12. Sin embargo, esta incapacidad para cultivar o almacenar islotes de alta calidad durante más de unos pocos días después del aislamiento hace que la agrupación de islotes sea logísticamente poco práctica. Una segunda estrategia es desarrollar una fuente alternativa de islotes, como los islotes derivados de SC, que ofrecen la emocionante promesa de un suministro ilimitado de islotes13,14 y una menor dependencia de la disponibilidad limitada de donantes. Los islotes derivados de SC producen insulina en respuesta a la glucosa, restablecen la normoglucemia en algunos modelos animales de trasplante y se han probado en ensayos de fase 1 y 2 en humanos. Sin embargo, la heterogeneidad en la composición de células endocrinas y la variabilidad en la función13 conducen a una considerable variabilidad de lote a lote15, lo que requiere una extensa validación previa al trasplante de cada lote, tiempo durante el cual los islotes SC se deterioran en cultivo. La incapacidad de almacenar islotes antes de su uso es un desafío común en ambas estrategias. Se requiere un almacenamiento a más largo plazo para superar las barreras de la cadena de suministro que limitan la disponibilidad de cantidades suficientes de islotes y para permitir una evaluación adecuada de la calidad antes del trasplante.

La crioconservación, o la estabilización de biomateriales a una temperatura ultrabaja (menos de -150 °C), puede lograr la acumulación, el almacenamiento a largo plazo y la disponibilidad inmediata de células y tejidos viables16,17. Las técnicas de crioconservación convencionales utilizan un enfriamiento lento (es decir, <1 °C min−1) de sustancias biológicas hasta un estado congelado deshidratado con presencia de hielo extracelular. La adición de una concentración baja (~2 M) de CPA ayuda a estabilizar las células durante la crioconservación y mejora la viabilidad celular. A pesar de la extensa investigación (Tabla complementaria 1 y los estudios revisados ​​en Kojayanet al.18), persisten los desafíos para la criopreservación de islotes debido a lesiones relacionadas con el hielo (es decir, viabilidad subóptima), incapacidad para lograr escalabilidad clínica y uso de componentes no aceptados clínicamente ( es decir, suero bovino fetal) necesarios para mejorar la viabilidad.

Una alternativa prometedora a los métodos de crioconservación convencionales existentes es la vitrificación sin hielo; es decir, enfriamiento rápido de un biomaterial a un estado similar al vidrio19,20. Para evitar la formación de hielo, las tasas de enfriamiento y calentamiento subsiguientes deben exceder la tasa crítica de enfriamiento (CCR) y la tasa crítica de calentamiento (CWR), respectivamente. El aumento de la concentración de CPA (>4 M) puede reducir la CCR y CWR requeridas a niveles alcanzables, pero causa toxicidad en células y tejidos, especialmente a temperaturas más altas (>4 °C). Por lo tanto, existe un punto de equilibrio crítico que evita tanto las lesiones por hielo como por la toxicidad de CPA mientras se mantiene la escalabilidad clínica. Las estrategias anteriores de vitrificación de islotes se limitaban a pequeños volúmenes con cantidades bajas de islotes (<150 islotes en volúmenes de microlitros de solución de CPA; Tabla complementaria 1) para garantizar tasas de enfriamiento y calentamiento suficientes, y el aumento volumétrico redujo las tasas de enfriamiento y calentamiento y condujo a formación de hielo, comprometiendo la viabilidad. Hasta donde sabemos, ninguna técnica publicada ha logrado simultáneamente la criopreservación de islotes con alta viabilidad, función y recuperación en un protocolo clínicamente escalable (Tabla complementaria 1).

Para lograr este objetivo, llevamos a cabo investigaciones sistemáticas sobre el CPA (formulación, concentración, carga y descarga) y el método de vitrificación (mejora de las tasas de enfriamiento y recalentamiento) para desarrollar un nuevo método de criopreservación de islotes que logra simultáneamente una alta recuperación, viabilidad, funcionalidad y escalabilidad. Validamos nuestros métodos en islotes derivados de ratones, porcinos, humanos y SC humanos. Se realizaron extensas evaluaciones in vitro de viabilidad, salud metabólica y secreción de insulina. Finalmente, utilizando modelos de trasplante singénico y xenogénico, demostramos que después de la RV, los islotes siguen siendo viables in vivo, producen insulina, responden al desafío glucémico y curan la diabetes. La descripción general de nuestra técnica se resume en la Fig. 1a.

a, La crioconservación puede ser la piedra angular de una cadena de suministro de islotes, lo que permite la agrupación, el almacenamiento y el control de calidad antes del trasplante. Los sistemas modelo utilizados para explorar esto incluyen islotes de ratones, porcinos y humanos e islotes SC-beta. Para lograr una alta recuperación, viabilidad, función y escalabilidad simultáneamente, se realizó en estos sistemas de islotes una optimización sistemática de parámetros interrelacionados, incluida la toxicidad CPA, la formación de hielo y las tasas de enfriamiento y calentamiento durante la criopreservación VR. Las tasas de enfriamiento y calentamiento logradas pueden ajustar el equilibrio entre la toxicidad de CPA y la formación de hielo. La morfología de los islotes, la viabilidad, la salud metabólica y la función in vitro e in vivo se evaluaron después de la criopreservación VR. hESC, célula madre embrionaria humana. b, Esquema de criomesh VR (no a escala). Después de la carga de CPA, los islotes en suspensión se transfirieron a la criomalla y se eliminó el exceso de solución de CPA antes de sumergirlos en nitrógeno líquido (LN2). c, Perfil de temperatura medido representativo de criomesh VR. El recuadro son las tasas de enfriamiento y calentamiento logradas (n = 6, datos presentados como media ± sd con puntos de datos individuales). d, la correlación de la concentración de CWR y CPA (ecuación (S2) en los materiales complementarios) indica que se requiere un mínimo de ~44 % en peso de CPA para evitar el hielo letal usando cryomesh VR y muestra dónde otros estudios han fallado al usar un CPA con un CWR adecuado para evitar el hielo en sus condiciones de rendimiento térmico.

Para este estudio, probamos la función de criopreservación y poscalentamiento de islotes de ratones, porcinos, humanos y SC-beta. Los islotes SC-beta eran agrupaciones generadas por la diferenciación de una línea SC embrionaria humana (HUES8) en seis etapas mediante programación no genética en cultivo en suspensión 3D21. La Fig. 1 complementaria muestra un ejemplo de caracterización específica de células SC-beta durante cada etapa de diferenciación. Se usaron islotes de ratón e islotes SC-beta para el desarrollo inicial, y luego se validó el enfoque usando islotes humanos y porcinos.

Primero analizamos varios enfoques de realidad virtual y evaluamos su rendimiento en refrigeración, recalentamiento y escalabilidad. Comparamos tres estrategias de realidad virtual basadas en gotas de uso común: (1) enfriamiento del plato de cobre y calentamiento por convección, (2) enfriamiento del plato de cobre y nanocalentamiento por láser (se agregaron nanobarras de oro a la gota para generar calor con la irradiación del láser) y (3) enfriamiento por convección. enfriamiento y calentamiento con un dispositivo cryotop (Fig. 2 complementaria; detalles en Métodos). Brevemente, se vitrificaron de 10 a 20 islotes en una gota de 2 µl y posteriormente se recalentaron. Evaluamos las tasas de enfriamiento y calentamiento por medición directa o por estimación a través de modelos (Tabla complementaria 2)16. La viabilidad posterior a la descongelación fue del 56 %, 62 % y 55 % utilizando los enfoques 1, 2 y 3, respectivamente. En general, cada uno de estos enfoques sufrió de viabilidad subóptima y desafíos potenciales en la escalabilidad (detalles en Resultados complementarios y discusión).

Para superar estas limitaciones basadas en gotitas, a continuación probamos un sistema de malla criogénica que puede crioconservar con éxito embriones de Drosophila melanogaster22. La criomalla consta de una malla de nailon (tamaño de poro de 38 µm) unida a un mango de plástico. Después de cargar CPA en los islotes mientras estaba en suspensión, los islotes se transfirieron a un soporte de malla criogénica y el exceso de solución de CPA se eliminó mediante mecha; este es un paso crítico, ya que reduce la mayor parte de la masa térmica en el sistema, dejando una fina capa de islotes en la malla criogénica rodeada por un volumen mínimo de CPA (Fig. 1b). Al eliminar este exceso de líquido, las tasas de enfriamiento y calentamiento aumentan aproximadamente en un orden de magnitud a 5,4 × 104 y 30,9 × 104 °C min−1, respectivamente, durante el enfriamiento/calentamiento por convección (Fig. 1c). La eliminación de CPA también aumenta la densidad de los islotes dentro del sistema frente a una gota. Por ejemplo, una monocapa apretada de islotes en una malla de nailon de 2 cm × 2 cm (es decir, 1,7 × 104 islotes) es >95 % del volumen de la criomalla, mientras que 20 islotes en una gota de 2 µl ocupan solo el 1,8 %. del volumen total. La Tabla complementaria 2 resume el rendimiento de los enfoques de criomalla, gota y criotop VR, enfatizando tanto las tasas mejoradas de enfriamiento y calentamiento como la capacidad de ampliar la criomalla.

Habiendo establecido el rendimiento térmico del sistema criomesh, buscamos una formulación de CPA y un protocolo de carga/descarga que evitaría la formación de hielo y minimizaría la toxicidad. A través de una correlación entre la concentración de CPA y CWR (ecuación (S2)), estimamos que la concentración mínima de CPA en el interior de un islote debe ser del 42–44 % en peso para evitar la desvitrificación (formación de hielo) durante el recalentamiento a 30,9 × 104 °C min−1 usando la criomalla (Fig. 1d). La toxicidad de CPA puede ocurrir tanto por daño químico como osmótico. Para evitar lesiones, probamos la adición de CPA paso a paso para minimizar el daño osmótico (es decir, la contracción extrema del volumen por debajo del 60 % o la expansión del volumen por encima del 153 %) durante la carga y descarga, y también evaluamos la toxicidad química en función de la duración de los pasos y una variedad de formulaciones de CPA .

Para desarrollar un protocolo CPA de carga y descarga optimizado, primero fabricamos un dispositivo microfluídico para medir los parámetros biofísicos de los islotes, incluido el volumen inactivo osmótico (Vb), la permeabilidad al agua de la membrana (Lp) y la permeabilidad CPA (ω). Vb se midió registrando el volumen de equilibrio final de los islotes en varias concentraciones de solución hipertónica de NaCl (Fig. 2b, panel inferior). Los diagramas de Boyle-van't Hoff indican que el volumen osmóticamente inactivo para los islotes de ratón y SC-beta fue de 0.5 y 0.4, respectivamente (Fig. 2c). Los parámetros de permeabilidad de la membrana (Lp, ω) se determinaron registrando el comportamiento característico de contracción-hinchazón de los islotes tras la exposición a soluciones de CPA que contenían 15 % en peso de propilenglicol (PG), etilenglicol (EG) y dimetilsulfóxido (DMSO) a 4 °C. C y 21 °C (Fig. 3 complementaria). El "encogimiento" se produce debido a la alta permeabilidad al agua tras la exposición inicial de CPA, lo que impulsa la salida de agua de los islotes. Este encogimiento es seguido por un 'hinchamiento' a medida que el CPA permeable se difunde a través de la membrana celular y el agua vuelve a entrar lentamente en los islotes (Fig. 2b, panel superior). Usamos el modelo de dos parámetros basado en Lp y Ps (= ωRT, R es la constante del gas, T es la temperatura absoluta) para ajustar las curvas experimentales de contracción-hinchazón (detalles en Métodos). Como se muestra en la Fig. 2e, el agua (Lp) y la permeabilidad de CPA (ω) tienen valores más altos a una temperatura más alta para los islotes de ratón y SC-beta. Las diferentes composiciones celulares entre el ratón y los islotes SC-beta probablemente condujeron a la diferencia en los valores de permeabilidad entre los dos tipos de islotes. Aunque lo anterior describe el encogimiento-hinchazón durante la carga, ocurre lo contrario durante la descarga, que es un hinchamiento seguido de un encogimiento, como se señaló en otra parte23.

a, Esquema del dispositivo de microfluidos utilizado para medir las propiedades biofísicas de los islotes (no a escala). Los cambios morfológicos de los islotes se registraron a través de un microscopio. PDMS, polidimetilsiloxano. b, Arriba: cuando se somete a DMSO al 15 % en peso a 4 °C, el islote primero se contrae y luego se hincha. Tras la exposición al CPA hipertónico, el agua sale de las células y el islote se encoge. Luego, el CPA se difunde a través de las membranas celulares, seguido por el agua que vuelve a ingresar a la célula, lo que lleva a la hinchazón hacia su estado inicial. Abajo: El islote permaneció encogido en solución de NaCl ya que las células son impermeables a la sal. Barras de escala, 100 µm. c, los diagramas de Boyle-van't Hoff de islotes SC-beta y de ratón muestran el volumen de islote normalizado (V/V0) en función de la relación de osmolalidad de la solución de NaCl isotónica e hipertónica (π0/π). El volumen osmótico inactivo (Vb) que no participa en la respuesta osmótica se puede estimar extrapolando el ajuste lineal a π0/π = 0. Se pueden encontrar más detalles en Métodos (n = 4 para islotes SC-beta, n = 8 para islotes de ratón). d, volumen normalizado de ratón e islotes SC-beta frente al tiempo que demuestra el comportamiento de contracción-hinchamiento cuando se expone a 15 % en peso de DMSO a 21 °C (n = 3 para islotes de ratón, n = 9 para islotes SC-beta). e, Tabla resumen de la permeabilidad al agua (Lp) y CPA (ω) de islotes SC-beta y ratones a 4 °C y 21 °C (n = 3–9; el tamaño exacto de la muestra se puede encontrar en la Fig. 3 complementaria). El color rojo representa el islote del ratón en los paneles c, d, g, h, y se usa en el panel e para mantener la coherencia con el resto de los paneles. f, carga por pasos (pasos 1 a 3) y descarga (pasos 4 a 7) de 22 % en peso de EG + 22 % en peso de DMSO para los islotes. g, cambio de volumen normalizado de islote modelado durante la carga/descarga de CPA usando las propiedades biofísicas medidas. El volumen de los islotes de ratón y SC-beta se mantuvo en la región segura. h, concentración de CPA modelada en el ratón y en los islotes SC-beta. Para c–e, los datos se presentan como media ± sd

Con estos parámetros (Vb, Lp y ω), se modelaron la concentración de CPA intracelular, el volumen de los islotes y la toxicidad química durante una carga y descarga de varios pasos (ecuaciones (2) y (3) en Métodos, ecuación S1 en Métodos complementarios). Después de la optimización, nuestro protocolo de carga de CPA usó los siguientes intervalos de 10 minutos: 21 °C a 1,3 M, 4 °C a 3,2 M y 4 °C a 6,5 ​​M (Fig. 2f; detalles en Resultados complementarios y discusión). Las excursiones de volumen de islotes SC-beta y de ratón se mantuvieron dentro de las tolerancias osmóticas (Fig. 2g). El modelo predijo que la concentración de CPA sería de 6,2 M dentro de los islotes de ratón y de 6 M para los islotes SC-beta (Fig. 2h).

Para optimizar la formulación de CPA, probamos tres concentraciones generales de CPA (33 %, 44 % y 54 %) que consistían en PG, EG, DMSO o mezclas. Utilizamos tinción viva / muerta cualitativa y cuantitativa para medir la viabilidad de los islotes SC-beta para cada CPA después de la carga y descarga (Fig. 2f) y nuevamente después de VR. Las mediciones cualitativas se determinaron mediante imágenes confocales de islotes intactos después de teñir con naranja de acridina (AO) y yoduro de propidio (PI) (Fig. 3a). Para la medición cuantitativa, los islotes tratados con CPA con o sin VR se disociaron en células individuales y se tiñeron con AO/PI, y se contó el porcentaje de células vivas (AO+/PI-) (Fig. 3b). La viabilidad medida después de la carga y descarga reflejó la toxicidad de CPA. Una mayor disminución de la viabilidad después de la VR presumiblemente reflejó una lesión relacionada con el hielo durante el enfriamiento y el recalentamiento.

a, Imágenes de microscopio confocal de controles vivos y muertos de islotes SC-beta teñidos con AO (cian) y PI (rojo). b, Imágenes de microscopio confocal (fusión AO/PI) de islotes SC-beta tratados con CPA (solo carga y descarga de CPA) y tratados con VR (carga de CPA, descarga de VR y CPA). Se examinaron varias formulaciones de CPA. c, Viabilidad celular de islotes SC-beta tratados solo con CPA (cian), tratados con VR (verde) y control vivo (rojo). Los islotes se disociaron en células individuales y luego se midió la viabilidad. El texto amarillo en b, c se usa para resaltar la condición óptima. Se usó el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) con la prueba post hoc de Tukey para comparar grupos, y se muestran los valores de P de comparaciones informativas por pares (n = 4). d, e, para la viabilidad de las células de los islotes de ratón ( d ) y SC-beta ( e ) después de diferentes tiempos de cultivo (0, 3 y 24 h) después del tratamiento solo con CPA y luego después del tratamiento con VR. Se usó ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de Tukey para comparar grupos, y se muestran comparaciones informativas por pares (n = 4). Barras de escala, 100 µm. Los datos se muestran como puntos de datos individuales y media ± sd

Después de la carga y descarga de CPA, EG demostró la menor toxicidad de los islotes de los tres componentes individuales, seguido de DMSO y PG (Fig. 3c). Cuando las mezclas se usaron a la misma concentración total (44 %), una mezcla de EG y DMSO proporcionó la menor toxicidad (la viabilidad celular fue del 96,4 % del control), superando a EG o DMSO solo. La viabilidad de los islotes también se mantuvo alta (93, 3% del control) después de VR y permaneció esencialmente sin cambios durante 24 h de cultivo posterior a VR (Fig. 3d, e). La disminución de la concentración de la mezcla (al 34 %) condujo a una menor viabilidad posterior a la VR debido a la formación de hielo; aumentar la concentración (al 54%) resultó en una menor viabilidad debido a la toxicidad de CPA (Fig. 3c). Durante todo el estudio se utilizó la formulación de CPA mejor identificada (22 % de EG + 22 % de DMSO).

Usando la formulación optimizada de CPA, las condiciones de carga y descarga y el sistema de criomalla de enfriamiento/recalentamiento, examinamos la morfología de los islotes, la viabilidad, la fragmentación del ADN (tinción de marcaje del extremo de la mella dUTP mediada por TdT (TUNEL)) y la translocación de la anexina V después de la realidad virtual. Comparamos la RV con el control vivo sano, el control muerto (tratado con etanol) y los islotes criopreservados convencionalmente (es decir, enfriamiento lento en DMSO al 15%) (Fig. 4). Después de VR, cada uno de los cuatro tipos de islotes (ratón, humano, porcino y SC-beta) tenía una apariencia general y una viabilidad similar a los islotes de control frescos y mucho mejor que los islotes criopreservados convencionalmente (Fig. 4a). Los islotes VR tenían bordes suaves, forma redondeada/oblonga y una apariencia histológica normal indistinguible de los islotes frescos, mientras que muchos islotes criopreservados convencionalmente demostraron una alteración de la arquitectura macroscópica. Las diferencias fueron aún más evidentes en el examen ultraestructural utilizando microscopía electrónica de transmisión (TEM) (Fig. 4a, abajo). Las imágenes de TEM mostraron que las membranas celulares y nucleares, las mitocondrias, los gránulos secretores y otros orgánulos aparecían intactos en los islotes VR. Por el contrario, los islotes criopreservados convencionalmente tenían cambios cualitativos importantes en la apariencia celular, números reducidos de mitocondrias y gránulos secretores y ampollas sustanciales en las membranas celulares y nucleares.

a, La morfología de los islotes de ratón de control vivo, VR (criopreservados por VR) y convencional (criopreservados por congelación lenta convencional) se evaluó mediante microscopía de campo claro, histología de hematoxilina y eosina (H&E) y TEM. Para el grupo convencional, se observó una mezcla de islotes intactos y rotos. En la histología de campo claro y H&E se muestran ejemplos de morfología macroscópica de islotes interrumpida debido a la formación de hielo. b, Viabilidad (porcentaje de control vivo) de islotes de ratón, SC-beta, porcinos y humanos de grupos de tratamiento que incluyen control vivo, VR, VR 9 meses (islotes almacenados en LN2 durante 9 meses antes del recalentamiento), convencional (criopreservados por métodos lentos convencionales) congelación) y control muerto (tratado con etanol al 75%). ND, no hecho. Se usó ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de Games-Howell para comparar grupos, y se muestran los valores de P de comparaciones informativas por pares (n = 3–34 por grupo; número exacto en la Tabla complementaria 3). c, Imágenes de microscopio confocal (AO/PI) de islotes de ratón, SC-beta, porcinos y humanos de grupos de tratamiento, incluido el control vivo, VR y convencional. d, imágenes teñidas con TUNEL de islotes de ratón, SC-beta y humanos de grupos de tratamiento, incluido el control en vivo, VR y convencional. El panel inferior es la tinción con anexina V de islotes de ratón de los mismos grupos de tratamiento. Las barras de escala representan 2 µm para TEM, 50 µm para imágenes de campo claro, 70 µm para histología e imágenes TUNEL y 100 µm para todas las imágenes de fluorescencia. Los datos se muestran como puntos de datos individuales y media ± sd

A continuación, utilizamos la tinción AO/PI para medir los cambios en la viabilidad asociados con cada técnica de criopreservación de islotes. Cualitativamente, los islotes VR parecían similares a los islotes de control en vivo, con solo un ligero aumento en la cantidad de células rojas (necróticas o muertas) (Fig. 4c y Fig. 5 complementaria) para cada uno de los cuatro tipos de islotes. Los islotes criopreservados convencionalmente mostraron mucha más muerte celular. Después de la crioconservación, se disoció un conjunto separado de islotes en una suspensión de una sola célula y se probó la viabilidad por célula (Fig. 4b). La viabilidad posterior a la RV, en relación con el control, fue del 90,5 % para ratón, 92,1 % para SC-beta, 87,2 % para porcino y 87,4 % para humanos. La viabilidad no cambió durante 9 meses de criopreservación (88,3 % para islotes de ratón y 91,8 % para SC-beta). La crioconservación convencional dio como resultado una viabilidad más baja (59,1–62,2 %) que los islotes VR.

Aunque examinamos principalmente la viabilidad general de las células de los islotes, para evaluar específicamente la viabilidad de las células que expresan insulina (beta), costinemos islotes intactos o disociados con colorantes vivos/muertos reparables y anticuerpos anti-insulina y luego evaluamos la viabilidad de las células beta mediante microscopía confocal (cualitativa). medidas, Fig. 6 complementaria) y FACS (medidas cuantitativas, Fig. 7 complementaria) y encontró que tanto las células positivas como las negativas de insulina parecían tener viabilidades similares (detalles en Resultados complementarios y discusión).

Además del bajo grado de muerte celular observado (células PI+) con los islotes VR, observamos un poco más de células TUNEL+ y de anexina V+ en la superficie celular después de la VR en comparación con los islotes de control frescos (Fig. 4d y Fig. 8 complementaria), lo que sugiere tanto la necrosis como la apoptosis pueden contribuir a la disminución general de 8 a 12 % en la viabilidad con VR. Se observaron muchas más células TUNEL+ y Anexina V+ con islotes criopreservados convencionalmente. En comparación con la criopreservación convencional, nuestra técnica de realidad virtual resultó en mejoras sustanciales en la preservación de la viabilidad y la morfología de los tipos de islotes probados.

Debido a que la viabilidad medida por los tintes de permeabilidad de la membrana representa un indicador rezagado de la disfunción de los islotes después del tratamiento, buscamos examinar otras medidas de la salud de los islotes que podrían definir mejor la función esperada de los islotes después de la criopreservación. Específicamente, la salud metabólica, particularmente la OCR de los islotes, predice la función de los islotes in vivo24,25. Primero examinamos los niveles de ATP en los islotes inmediatamente después de la VR y descubrimos que, en ese momento, el contenido de ATP era notablemente más bajo que en los islotes de control (Fig. 9 complementaria). Sin embargo, los niveles de ATP y otras medidas metabólicas (OCR y potencial de membrana mitocondrial) se recuperaron en gran medida después de 3 h de cultivo. Utilizamos ese punto de tiempo para todas las evaluaciones posteriores.

El potencial de la membrana mitocondrial en cada uno de los cuatro tipos de islotes se midió mediante tinción con éster etílico de tetrametilrodamina (TMRE) y microscopía confocal cualitativa y cuantitativa. La intensidad de la señal general fue algo más baja para los islotes VR que para el control vivo (65,7–86,3 % del control), pero cuando se ajustó según el contenido de células viables, la intensidad de TMRE fue del 75,1–93,7 % del control (Fig. 5b, izquierda). La diferencia en la intensidad de TMRE puede deberse a una recuperación más lenta en el centro de los islotes donde hubo algo de transparencia central. Esta apariencia pareció mejorar aún más con 24 h de cultivo (Fig. 9 complementaria). La intensidad de tinción de TMRE para los islotes criopreservados convencionalmente fue del 37 al 42% de los islotes de control (Fig. 5b).

a, Potencial de membrana mitocondrial (mediante tinción TMRE) de islotes de ratón, SC-beta, porcinos y humanos de los grupos de tratamiento, incluido el control en vivo, VR y convencional. b, Izquierda: cuantificación de la intensidad de tinción de TMRE. Las comparaciones que se muestran entre los grupos de control vivo y de tratamiento se realizaron mediante pruebas de Kruskal-Wallis y de Wilcoxon por pares (n = 3-16 por grupo). Derecha: Medición de los niveles de ATP de cuatro tipos de islotes de grupos de control vivos y muertos y grupos de criopreservación (VR y convencional). Se usó ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de Games-Howell para comparar grupos, y se muestran los valores de P de comparaciones informativas por pares (n = 3-12/grupo). c, Curva de OCR de ejemplo que muestra el cambio en OCR durante la prueba Mito Stress en islotes SC-beta y compara islotes de control vivo, VR, criopreservación convencional y control muerto (n = 5–8 por grupo en cada punto de tiempo). d, Compilación de los parámetros OCR metabólicos para cada tipo de islote y cada grupo de tratamiento. Se usó ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de Tukey para comparar grupos, y se muestran diferencias significativas (P < 0.05) por pares (n = 3–33 por grupo). e, Ensayo GSIS in vitro para islotes de ratón, SC-beta y humanos de grupos de tratamiento, incluido el control en vivo, VR y convencional. Se usó ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de Tukey para comparar grupos, y se muestran comparaciones informativas por pares (n = 3–12/grupo). En b, d y e, los valores P de comparación estadística relevantes se incluyen dentro de las gráficas. Barras de escala, 100 µm. Los datos se muestran como puntos de datos individuales y media ± sd Para b – e, el número exacto de repeticiones se puede encontrar en la Tabla complementaria 3. RLU, unidades de luz relativas.

El número y la apariencia de las mitocondrias vistas por TEM de los islotes VR fueron cualitativamente similares a las células de los islotes de control (Fig. 4a, abajo). De manera similar a los hallazgos de TMRE, los niveles generales de ATP en los islotes VR fueron ligeramente menores que en los islotes de control frescos (Fig. 5b, derecha). Estos datos sugieren que la maquinaria celular para producir ATP permaneció intacta, pero los niveles de ATP aún no se habían restaurado por completo a los valores de control en el punto de tiempo analizado.

Habiendo mostrado mitocondrias intactas, luego observamos la respiración celular para evaluar si los islotes VR consumían oxígeno para restaurar ATP. En comparación con los islotes de control frescos, los islotes VR mostraron un patrón similar de cambios en OCR después de la estimulación con oligomicina (ATP sintasa/inhibidor del complejo V), cianuro de carbonilo 4-trifluorometheoxifenilhidrazona (FCCP) (agente desacoplador de la membrana mitocondrial) y una mezcla de rotenona (inhibidor del complejo I) y antimicina A (inhibidor del complejo III) (Fig. 5c). Los islotes criopreservados convencionalmente mostraron una respuesta de estrés OCR atenuada. Al comparar VR con control fresco en islotes de ratones, humanos y SC-beta, no hubo diferencias en OCR para la respiración basal, la producción de ATP, la fuga de protones, la respiración máxima, la capacidad respiratoria de reserva y la respiración no mitocondrial (Fig. 5d). Estos datos sugieren que los islotes VR mantienen una función metabólica normal medida por la respiración celular.

Realizamos pruebas GSIS para determinar si los islotes eran funcionales in vitro. Los islotes de ratón, SC-beta y humanos secretaron insulina en respuesta al desafío con glucosa y, para ratón y SC-beta, además con despolarización completa usando KCl (Fig. 5e). Los islotes porcinos no se probaron. Los islotes humanos tuvieron una liberación máxima de insulina con la provocación con alto contenido de glucosa, pero ninguna liberación adicional con KCl. Los índices de estimulación (proporción de insulina liberada con la exposición de la concentración de glucosa alta a la de glucosa baja) para los islotes VR de cada tipo de islote medido no fueron diferentes de los islotes de control. Los islotes criopreservados convencionalmente también mostraron liberación de insulina en respuesta al desafío con glucosa, pero en menor grado. Estos datos confirman que los islotes VR son viables, metabólicamente activos y funcionales in vitro.

Como medida final de la función de los islotes posterior a la VR, probamos los islotes de ratón, porcino y SC-beta en modelos de trasplante de ratón singénico y xenogénico (Fig. 6). Los islotes de ratón singénicos trasplantados debajo de la cápsula renal demostraron función y restauraron la normoglucemia dentro de las 48 h (Fig. 6a) y mostraron una intensa tinción de inmunofluorescencia de insulina similar a los islotes de control en el día 60 posterior al trasplante, al igual que los xenotrasplantes porcinos y SC-beta en inmunodeficientes no obesos diabéticos-scid -Il2rgc−/− (NSG) destinatarios (Fig. 6b). Los islotes de ratón y porcino también tenían una tinción intensa con glucagón, aunque potencialmente con una ligera reducción cualitativa en la intensidad de la señal en comparación con los islotes de control. Como era de esperar, los trasplantes SC-beta mostraron una tinción de glucagón débil, ya que se habían diferenciado a un linaje de células beta21,26. Los islotes criopreservados convencionalmente tenían una intensidad de tinción de insulina o glucagón muy baja.

a, Niveles de glucosa en sangre de ratones diabéticos inducidos por estreptozotocina después del trasplante singénico de islotes de ratón de masa marginal (250 islotes por receptor) de grupos de tratamiento, incluido el control vivo, VR, VR con almacenamiento crioconservado de 9 meses (islotes almacenados en LN2 durante 9 meses ) y criopreservación convencional (450 islotes por recipiente). Se muestran todas las comparaciones por pares con un valor de P <0,05 (*P < 0,05), según lo determinado por ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de Games-Howell [(n = 10 (control y crioconservación convencional), 9 (VR), 1 ( función parcial VR) y 3 (almacenamiento de 9 meses y VR)). b, tinción de insulina (rojo) y glucagón (verde) en modelos de trasplante de ratón singénicos (ratón) y xenogénicos (porcino y SC-beta). Los grupos de tratamiento de islotes incluyen control en vivo, VR y convencional. La tinción con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (azul) se muestra en las imágenes combinadas. c, IPGTT de ratones de tipo salvaje (WT), ratones diabéticos y ratones diabéticos trasplantados con control vivo, VR e islotes crioconservados convencionales (izquierda). Área bajo la curva (AUC) de IPGTT (panel derecho). Los grupos se compararon mediante ANOVA unidireccional y prueba post hoc de Tukey, y solo se muestran comparaciones por pares informativas (n = 9-10 por grupo). d, xenotrasplante de islotes SC-beta en ratones NSG con niveles de insulina humana en plasma sin ayuno a las 4, 8 y 12 semanas después del trasplante. e, A las 14 semanas, el nivel de insulina en plasma de los ratones NSG después del ayuno y 30 minutos después de estimular la producción de insulina mediante inyección de glucosa intraperitoneal. Para d y e, la comparación de grupos se realiza mediante ANOVA unidireccional y prueba post hoc de Tukey y se muestran comparaciones informativas (n = 3–5/grupo de tratamiento). Barras de escala, 200 µm. Los datos se muestran como puntos de datos individuales y media ± sd Para c – e, el número exacto de repeticiones se puede encontrar en la Tabla complementaria 3.

Usando un modelo de trasplante xenogénico, luego probamos la función de los islotes SC-beta in vivo. Los islotes SC-beta se trasplantaron en ratones NSG no diabéticos y se obtuvieron muestras de suero al azar para medir la insulina humana a las 4, 8 y 12 semanas después del trasplante (Fig. 6d). Los islotes VR secretaron insulina humana durante las 12 semanas. Los islotes SC-beta criopreservados convencionalmente tenían una producción de insulina humana detectable, pero estos niveles no eran estadísticamente diferentes de los receptores de trasplantes simulados. A las 14 semanas, se analizó el ayuno de los ratones receptores y se estimuló la producción de insulina humana mediante inyección intraperitoneal de glucosa (Fig. 6e). Los receptores de trasplantes de islotes criopreservados convencionalmente tenían insulina humana detectable, pero no hubo un aumento en los niveles después de la estimulación. Los receptores de islotes VR tenían niveles en ayunas más altos que los islotes crioconservados simulados o convencionales y demostraron un aumento de 2,3 veces después de la estimulación, lo que confirma la función SC-beta in vivo.

A continuación, se probaron los islotes de ratón de control fresco, VR y criopreservados convencionalmente en un modelo de trasplante de islote singénico de masa marginal (250 islotes por receptor) utilizando receptores diabéticos inducidos por estreptozotocina. En general, los islotes VR restauraron rápidamente la normoglucemia en el 92% (11/12) de los receptores dentro de las 24-48 h (Fig. 6a). En la evaluación bivariada de Kaplan Meier, el tiempo hasta la normoglucemia no fue diferente de los receptores de trasplante de islotes de control vivo (prueba de rango logarítmico, P = 0,063). Un receptor de islotes VR demostró solo una función parcial, posiblemente debido a problemas técnicos (es decir, fuga de islotes de la cápsula renal). El nivel de azúcar en la sangre de ese receptor cayó por debajo de 200 mg dl-1 en el día 13 posterior al trasplante y luego exhibió una hiperglucemia moderada continua.

Por el contrario, los islotes criopreservados convencionalmente no lograron normalizar la glucosa en sangre (BG) en todos los receptores, incluso con un mayor número de islotes (450 islotes por receptor). Un subconjunto de trasplantes se sometió a nefrectomía unilateral del riñón con injerto de islotes (Fig. 10 complementaria). La hiperglucemia se desarrolló rápidamente en todos los ratones, lo que confirma que los islotes trasplantados, no los islotes receptores nativos, controlaban los niveles de glucosa en sangre.

En los trasplantes singénicos, el control glucémico fue extremadamente estricto para los islotes VR. Los niveles de BG aleatorios no fueron más altos que los de los trasplantes de islotes de control a lo largo del curso posterior al trasplante (hasta 150 días después del trasplante). Para probar el resultado del tiempo prolongado de criopreservación, vitrificamos los islotes, los almacenamos en LN2 durante 9 meses y luego los volvimos a calentar. Estos trasplantes de islotes almacenados a largo plazo también demostraron una rápida normalización de la glucosa en sangre y estabilidad de la glucosa durante todo el período de seguimiento.

Para demostrar el nivel de control glucémico, realizamos una prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (IPGTT) en el día 50 posterior al trasplante (Fig. 6c). No hubo diferencias en las curvas de respuesta de glucosa (Fig. 6c, izquierda) o las áreas bajo las curvas (Fig. 6c, derecha) para ratones de tipo salvaje no tratados, trasplantes de islotes de control frescos y trasplantes VR. Los receptores de islotes criopreservados convencionalmente tuvieron una respuesta glucémica similar a la de los ratones de control diabéticos.

La recuperación de islotes de nuestro proceso de realidad virtual a escala estándar (400–2000 islotes por prueba) fue del 96,8 ± 1,3 % para ratón (n = 26), 96,6 ± 1,7 % para SC-beta (n = 26), 91,3 ± 3,4 % para porcino ( n = 3) y 96,7 ± 1,5% para islotes humanos (n = 6) (Fig. 11 complementaria). Cuando escalamos a un rendimiento medio (2500 islotes por prueba), la recuperación de islotes de ratón fue del 95,9 ± 1,2 % (viabilidad del 89,4 %, n = 3), y la recuperación de islotes SC-beta fue del 98,2 ± 1,1 % (n = 4 ). Finalmente, en nuestra prueba inicial de prueba de concepto de VR de islotes SC-beta de mayor rendimiento (10 000 islotes por prueba), la recuperación fue del 92,6 % (n = 1).

Debido a que el sistema criomesh para VR es intrínsecamente unidimensional, la escala en las dimensiones x e y está teóricamente limitada solo por la geometría del contenedor. Para estos experimentos, los islotes se vitrificaron en una malla de 2 cm × 2 cm hasta 4250 islotes por cm2. Para lograr un rendimiento clínicamente significativo, se podrían conservar unidades de 100.000 islotes en criomallas de 24 cm2.

El trasplante de un número suficiente de islotes pancreáticos de alta calidad, viables y funcionales en un paciente diabético puede curar esta enfermedad cada vez más común y progresivamente debilitante. Una limitación importante que afecta el éxito del trasplante de islotes es la falta de un suministro bajo demanda de un número suficiente de islotes nativos o derivados de SC de alta calidad, una limitación que se ve agravada por la incapacidad de almacenar estos productos celulares antes de su uso. Aquí, mostramos, por primera vez, un método efectivo para la conservación de islotes a largo plazo que logra una alta viabilidad, recuperación, función y escalabilidad simultáneamente. Tal método para el banco de islotes pancreáticos a través de la crioconservación podría revolucionar la cadena de suministro para el aislamiento, la asignación y el almacenamiento de islotes antes del trasplante, aumentando la utilización general de páncreas de donantes fallecidos y curando a más pacientes de diabetes.

Estudios anteriores exploraron tanto los métodos convencionales (enfriamiento lento) como la vitrificación (enfriamiento rápido) para la crioconservación de islotes, logrando diversos grados de éxito (Tabla complementaria 1). Por ejemplo, Rajotte et al.27,28 y otros grupos29,30 demostraron la crioconservación convencional de islotes utilizando un CPA estándar (DMSO 2 M), pero solo lograron una viabilidad y función de bajas a moderadas y con un rendimiento limitado (10–100 islotes). Las mejoras en el protocolo (es decir, diferentes CPA) dieron como resultado una mejor función31,32 o un mejor rendimiento (≥10 000 islotes)33,34, pero no ambos simultáneamente. La criopreservación convencional se probó en ensayos clínicos limitados35, pero nunca se adoptó por completo debido en parte al uso de suero fetal bovino, que conlleva un riesgo de infección zoonótica. Mientras tanto, varios grupos han probado la vitrificación (es decir, la criopreservación sin hielo) como una alternativa favorable para mejorar la viabilidad y la función23,36,37,38,39. Los estudios iniciales demostraron la prueba del principio, pero con un bajo rendimiento de islotes (50–300 islotes) y función parcial23,40. Al cambiar la geometría del sistema mediante el uso de gotas41, fibras huecas39 o soportes de malla37,38, otros grupos mejoraron las tasas de enfriamiento y calentamiento y lograron mejoras modestas en la función, pero a costa de un menor rendimiento (a menudo, solo de 25 a 100 islotes a la vez). ).

Además de la eficacia en la crioconservación de islotes pancreáticos humanos, porcinos y de ratón recién aislados, el enfoque de realidad virtual también fue eficaz para los islotes humanos derivados de SC. Los islotes SC-beta proporcionan una fuente prometedora de células humanas para el reemplazo de células beta, lo que demuestra la secreción de insulina sensible a la glucosa in vitro y el control glucémico a largo plazo en modelos de ratones diabéticos21,42. Se están realizando grandes esfuerzos para mejorar la tecnología de células beta derivadas de SC para lograr una función fisiológica robusta; crear métodos de diferenciación eficientes y de bajo costo; y mejorar el complemento de células endocrinas (es decir, producir con una mezcla de células alfa y beta)43,44. No obstante, todavía se necesita un suministro sólido de islotes SC-beta de alta calidad, como los habilitados a través de la crioconservación, para lograr la disponibilidad inmediata para la futura adopción clínica. Nuestro método de crioconservación proporciona una solución potencial, demostrando una alta viabilidad (92,1 %) y funcionalidad in vitro e in vivo de los islotes SC-beta, incluso después de 9 meses de almacenamiento en LN2. El almacenamiento a largo plazo permitiría la manipulación inmunitaria de los posibles receptores, permitiría un control integral de la calidad de los islotes antes del trasplante y aumentaría la rentabilidad al permitir la crioconservación de grandes lotes en unidades funcionales para un solo paciente. Estos resultados sugieren que nuestro nuevo protocolo de criopreservación puede ser un medio poderoso para mejorar la cadena de suministro de islotes SC-beta, aumentando así las opciones terapéuticas para los pacientes diabéticos.

Tanto para los islotes SC-beta como para los islotes de donantes fallecidos, la escalabilidad del método de crioconservación es esencial. Se puede lograr una mayor ampliación de nuestro enfoque para un rendimiento clínico significativo (es decir, ≥100 000 islotes) utilizando tamaños de malla criogénica más grandes y factores de forma alternativos, como el apilamiento de mallas (Fig. 12 complementaria). Para un tamaño de criomalla más grande, cuando la malla se sumerge rápida y uniformemente, los flujos de enfriamiento y recalentamiento y la masa térmica (por unidad de área) permanecerán independientes del tamaño y la forma de la malla, en las condiciones en que los baños de enfriamiento/recalentamiento tengan el tamaño adecuado (es decir, , más grande que la criomalla) y se agita el baño de recalentamiento. Además, la solución de CPA restante (arrastrada debido a la tensión superficial) entre los islotes y la criomalla "pega" temporalmente los islotes a la criomalla, y los islotes no se separan de la criomalla durante el almacenamiento en LN2.

Nuestros hallazgos sientan las bases para la futura criopreservación clínica de islotes y sugieren que se puede lograr una alta viabilidad, funcionalidad (in vitro e in vivo) y escalabilidad simultáneamente durante la criopreservación de islotes de ratones, porcinos, humanos y SC-beta. Se necesitan más esfuerzos para abordar las limitaciones de nuestro enfoque, incluida la optimización de CPA para islotes humanos; mayor caracterización de las respuestas al estrés, la adaptación y las lesiones de los islotes; ampliar a un rendimiento de >300 000 islotes por lote (los rendimientos típicos para el aislamiento de un solo donante son <300 000 IEQs5); y adaptación al procesamiento de grado clínico (detalles en Resultados complementarios y discusión). Creemos que cada una de estas limitaciones se superará fácilmente en el desarrollo futuro.

Las implicaciones de un método exitoso para la crioconservación de islotes antes del trasplante son profundas. Dicha tecnología tiene las siguientes ventajas: (1) eficacia mejorada a través de trasplantes de islotes de donantes agrupados en dosis altas; (2) mejores oportunidades para el control y la evaluación de la calidad; (3) mejor preparación del paciente al convertir una operación no planificada en un evento planificado; (4) disminución del riesgo mediante el uso de una sola infusión de islotes en lugar de infusiones repetidas; (5) mejor oportunidad para la compatibilidad HLA de donante y receptor seleccionando de un banco de opciones disponibles en lugar de usar el siguiente donante en línea; (6) protocolos de inducción de tolerancia facilitada que requieren el preacondicionamiento del receptor antes de los trasplantes, como la tolerancia lograda mediante la infusión de leucocitos apoptóticos del donante45 o el quimerismo mixto con islotes y trasplante SC hematopoyético derivado del donante; y (7) mejora de la utilización de órganos al promover el aislamiento de islotes y bancos de todos los donantes apropiados en lugar de solo donantes "óptimos" que históricamente han sido seleccionados para maximizar los rendimientos con la esperanza de trasplantes de un solo donante.

Los comités institucionales de cuidado y uso de animales de la Universidad de Minnesota (protocolo 1905-37028A) y la Clínica Mayo (protocolo A00003973) aprobaron los estudios con animales. Los ratones se alojaron con un ciclo de luz de 14 h encendido/10 h apagado, temperatura ambiente de 68 a 74 °F y 30 a 70 % de humedad en instalaciones libres de patógenos específicos (para ratones NSG) o convencionales (para ratones C57BL/6) .

Los islotes de ratón se aislaron de reproductoras retiradas C57BL/6 (edad no especificada, Charles River Laboratories) mediante digestión con colagenasa (CIzyme RI, VitaCyte) y enriquecimiento con gradiente de densidad Histopaque (Millipore Sigma)46. Luego, los islotes se seleccionaron a mano y se cultivaron en un biorreactor (reactor ABLE Biott, BWV-S03A) en medio S3 durante 16 h antes de su uso. Los islotes humanos se compraron a un proveedor comercial (Prodo Laboratories) y se cultivaron en medio PIM(S) Complete (Prodo Laboratories) hasta 7 días antes de su uso. Se aislaron islotes porcinos de cerdos Landrace adultos47.

Las células HUES8 se cultivaron como esferoides en matraces giratorios de 500 ml (Corning, 3153)21. Los cultivos en suspensión se establecieron sembrando 150 millones de células (5 × 105 células ml−1) en medio mTeSR1 (STEMCELL Technologies, 85850) con Y27632 10 µM (R&D Systems, 1254) y se mantuvieron a 70 rpm dentro de la incubadora humidificada a 37 °C. , 5% CO2 y 100% humedad. El medio se cambió a las 48 h a mTeSR1 sin Y27632. Las células se pasaron cada 72 h mediante la dispersión en células individuales usando Accutase (Millipore Sigma, A6964) con interrupción mecánica y se resuspendieron en mTeSR1 fresco con Y27632.

Las diferenciaciones SC-beta se iniciaron después de 3 días de formación y expansión del esferoide SC en medios mTeSR1 dentro de un matraz giratorio21,26. Se permitió que los grupos se asentaran por gravedad y los medios se reemplazaron con medios específicos del protocolo que incluían factores de crecimiento apropiados. La diferenciación celular se dirigió secuencialmente al endodermo definitivo, tubo intestinal primitivo, progenitor pancreático 1, progenitor pancreático 2, progenitores endocrinos y finalmente en SC-beta26. Los tipos de medios basales (S1, S2, S3 y BE5) se complementaron con señales inductivas (detalles en Métodos complementarios). Los islotes SC-beta se caracterizaron por citometría de flujo (detalles en Métodos complementarios).

Los dispositivos de microfluidos utilizados para medir los parámetros biofísicos de los islotes se fabricaron mediante procedimientos de litografía suave (detalles en Métodos complementarios). Los islotes seleccionados a mano se introdujeron en el dispositivo de forma retrógrada a través del orificio de salida. Después de iniciar el flujo anterógrado utilizando medios de islotes, se cargó CPA/solución salina de la concentración deseada a través de una bomba de jeringa. Para los CPA, se usaron EG, PG y DMSO al 15% en peso preparados en RPMI. Para las soluciones salinas se utilizó cloruro de sodio al 1,8%, 2,7%, 3,6% y 4,5% preparado en agua desionizada. Una vez que el islote se asentó en el suelo del canal, el caudal de CPA/solución salina se incrementó gradualmente mientras se minimizaba el movimiento y la rotación del islote. El flujo de solución se detuvo después de haber bombeado al menos cinco volúmenes de solución a través del dispositivo. Para los experimentos realizados a 4 °C, todo el experimento se realizó dentro de una cámara frigorífica mantenida a la misma temperatura. Los cambios en el área de la sección transversal de los islotes se registraron y analizaron utilizando MATLAB para estimar los cambios en el volumen esférico de los islotes.

Se aplicó un modelo de dos parámetros usando Lp (conductividad hidráulica, también llamada permeabilidad al agua) y ω (permeabilidad CPA) para ajustar los datos experimentales de contracción-hinchamiento48. Los supuestos se detallan en Materiales complementarios. El volumen celular osmótico inactivo, Vb, se determinó a partir de la relación de Boyle-van't Hoff49. La ecuación de Boyle-van't Hoff correlaciona el volumen de equilibrio de la celda con la osmolalidad de la solución no permeante de la siguiente manera:

donde V es el volumen de equilibrio de la celda, V0 es el volumen isotónico de la celda, Vb es la fracción de volumen osmóticamente inactiva de la celda, π0 es la osmolalidad isotónica y π es la osmolalidad de la solución no permeante.

Se usó MATLAB para ajustar el Lp y ω de los islotes SC-beta y de ratón de las curvas experimentales de contracción-hinchamiento. El modelado del cambio de volumen de los islotes y el CPA intracelular se basa en el modelo "desacoplado" de dos parámetros sugerido por Kleinhans48, de la siguiente manera:

donde V y A son el volumen y el área superficial de los islotes, respectivamente; nC es el número de moles de CPA dentro del islote; R es la constante de los gases; T es la temperatura absoluta; Lp y ω son la conductividad hidráulica y la permeabilidad de la membrana a CPA, respectivamente; y C es la molalidad. Los superíndices i y e denotan intracelular y extracelular, respectivamente. Los subíndices C y S denotan CPA permeante y solutos no permeables, respectivamente.

Los islotes se criopreservaron mediante un enfoque de congelación lenta ligeramente modificado basado en el protocolo previamente establecido por Rajotte et al.50. No se incluyó suero bovino fetal ni suero bovino fetal en la solución de CPA. A 21 °C, se añadió DMSO a la suspensión de islotes para lograr una concentración final de 2 M en un criovial. Después de una incubación de 25 min con DMSO, el criovial se colocó en un baño de etanol a -7,5 °C durante 5 min. Se enfrió una barra de metal en LN2 y se usó para sembrar hielo tocando la suspensión en el criovial. Después de 15 min de liberación de calor latente de fusión, el criovial se enfrió a 0,25 °C min-1 a -40 °C usando un congelador de velocidad de control (Kryo 560, Planer Limited) y luego se sumergió en LN2. La descongelación se logró utilizando un baño de agua a 37 °C. Los islotes descongelados se colocaron en sacarosa 0,75 M durante 30 min a 0 °C para eliminar el CPA intracelular.

El CPA de concentración completa utilizado fue EG al 22 % en peso + DMSO al 22 % en peso preparado en medio RPMI. Para cargar el CPA, los islotes se incubaron primero en CPA al 20 % (es decir, 4,4 % en peso de EG + 4,4 % en peso de DMSO) durante 10 min a 21 °C, seguido de CPA al 50 % durante 10 min a 4 °C y en 100 % CPA durante 10 min a 4 ° C. A continuación, la suspensión de islotes se transfirió a la malla criogénica colocada sobre un material absorbente (es decir, una toalla de papel). La solución de CPA se eliminó a través de la malla de nailon y los islotes permanecieron en la malla criogénica. Se evitó la formación de grumos de islotes. La criomalla se sumergió rápidamente en LN2 y se almacenó en un tanque de LN2. Para descongelar los islotes, la malla criogénica se sumergió rápidamente en la solución de recalentamiento que constaba de 11 % en peso de EG, 11 % en peso de DMSO y 5 % en peso de sacarosa a 4 °C para la eliminación de CPA. Después de 10 min, la solución de recalentamiento se diluyó dos veces usando una solución de sacarosa al 10 % en peso enfriada con hielo, y los islotes se incubaron durante otros 10 min a 4 °C. A continuación, los islotes se transfirieron a 21 °C y la suspensión se diluyó dos veces utilizando una solución de sacarosa al 10 % en peso. Después de 5 min, los islotes se volvieron a colocar en medio RPMI durante 15 min como último paso de eliminación de CPA. En ese momento, todos los islotes se desprendieron de la malla de nailon.

Usando el mismo procedimiento de carga de CPA que en el enfoque de criomesh VR, se incluyeron de 10 a 20 islotes en una gota de 2 µl y se colocaron en el cryotop. El cryotop se sumergió rápidamente en LN2 para la vitrificación. El proceso de recalentamiento y eliminación de CPA fue el mismo que el realizado en el criomesh VR.

Se dejó caer una gota de 2 µl, incluidos 10–20 islotes, sobre un plato de cobre que flotaba en LN2 para la vitrificación. La gotita vitrificada se recalentó por convección en la solución de descarga. Los pasos de eliminación de CPA se mantuvieron igual que en el enfoque de criomesh VR.

Se agregaron nanovarillas de oro (nanoComposix) a la gota para alcanzar la concentración de 2,8 × 1010 partes ml−1. Después de vitrificar la gota incrustada en el islote y la nanovarilla de oro (2 µl) en la placa de cobre preenfriada, se usó un láser de pulso de 1064 nm para recalentar la gota17. La duración del pulso fue de 7,5 ms y el voltaje del láser fue de 250 V. Se utilizó una cámara de alta velocidad (Nac Image Technology, Q1v) para registrar el proceso de calentamiento del láser a 4000 fotogramas por segundo.

Las ultraestructuras de los islotes fueron analizadas por TEM. Brevemente, los islotes se fijaron en glutaraldehído al 2,5 % en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M (pH 7,4) a 4 °C durante la noche y se posfijaron en tetróxido de osmio acuoso al 2 % durante 1 h, se deshidrataron gradualmente en etanol (30 % a 100 %) y óxido de propileno. , embebido en Epon812 y curado durante 48 h a 60 °C. Luego, las secciones ultrafinas de 65 nm se recolectaron en rejillas de cobre de malla 200 y se tiñeron con acetato de uranilo (15 min) y citrato de plomo (2 min) antes del examen por TEM. Las imágenes se capturaron con un microscopio electrónico de transmisión FEI Tecnai G2 Spirit (Thermo Fisher Scientific).

La medición cualitativa de la viabilidad de los islotes intactos se realizó utilizando AO y PI. Los islotes intactos se tiñeron con 8 ng ml−1 de AO y 20 ng ml−1 de PI (Millipore Sigma) durante 2 min a temperatura ambiente, se cubrieron con un cubreobjetos y se tomaron imágenes con un microscopio confocal invertido Olympus Fluoview 3000 (Olympus) con filtros de 502/525 nm para AO y filtros de 493/636 nm para PI. Las imágenes se capturaron a una resolución de 4020 × 4020 píxeles con un objetivo de aumento de 20 ×. Tenga en cuenta que los diámetros de los islotes en todas las imágenes confocales, aquí y durante todo el estudio, aumentan debido a la compresión del cubreobjetos utilizada para aumentar la profundidad de imagen efectiva.

La viabilidad cuantitativa se midió en células de islote disociadas. Después del tratamiento con islotes, los islotes se incubaron en un matraz de cultivo dinámico a 70 rpm, 37 °C y CO2 al 5 % durante 3 h en medio S3. Los islotes se disociaron en suspensiones unicelulares en TrypLE Express (Thermo Fisher Scientific, 12605010), se extinguieron con S3 que contenía suero fetal bovino y se tiñeron con 8 ng ml-1 de AO más 20 ng ml-1 de PI. Después de 15 s de incubación, se pipetearon 10 µl de la suspensión en los portaobjetos de cámara de recuento de células Countess (Thermo Fischer Scientific, C10228) y se cuantificó la viabilidad utilizando un contador de células Countess II FL (Invitrogen de Thermo Fisher Scientific, AMQAF1000). La precisión de la técnica de medición de la viabilidad cuantitativa disociada se validó comparando los valores con los obtenidos mediante el análisis de imágenes de reconstrucciones 3D de imágenes confocales de islotes intactos teñidos con AO/PI.

Antes de realizar el ensayo, los grupos de islotes recibidos se incubaron en un matraz de cultivo dinámico a 70 rpm, 37 °C y 5 % de CO2. Los islotes se tiñeron con 25 µl de 50 ng ml-1 de TMRE reconstituido, perclorato (Biotium, 70005) a temperatura ambiente durante 1 min y 45 s en portaobjetos de microscopio, se cubrieron con cubreobjetos (Chase Scientific, ZA0294) y se tomaron imágenes con un Olympus Fluoview 3000 confocal. microscopio invertido (filtros de excitación/emisión: 594/574 nm). Las imágenes fueron capturadas a una resolución de 4020 × 4020 utilizando un objetivo de aumento de 20 ×. El potencial de membrana del islote se cuantificó midiendo la intensidad de la fluorescencia utilizando el software Olympus CellSens Dimension (v1.17).

Los islotes se incubaron en un matraz de cultivo dinámico a 70 rpm, 37 °C y 5 % de CO2 antes de cada ensayo. Se seleccionaron a mano islotes de tamaño estándar (~150 µm) y se colocaron tres IEQ por pocillo en cada pocillo de placas negras de 96 pocillos (Greiner Bio-One, 89131-680) en 50 µl RPMI a 37 °C. A continuación, se añadieron a cada pocillo 50 µl de reactivo de viabilidad celular Promega CellTiter-Glo 3D precalentado. Se utilizó ATP estándar (Roche) como control positivo y se calibraron los resultados. La placa se selló, se cubrió con papel de aluminio y se colocó en un agitador orbital a temperatura ambiente durante 5 min a 80 rpm. A continuación, la placa se incubó a temperatura ambiente durante 25 min sin agitación. Se usó un lector de microplacas multimodo BioTek Synergy 2 para capturar la luminiscencia, que se analizó usando el software BioTek Gen5 y se informó como unidades de luz relativas por IEQ.

Los islotes se incubaron en un matraz de cultivo dinámico a 70 rpm, 37 °C y CO2 al 5 % durante 3 h antes de realizar el ensayo. La respiración celular se midió utilizando las placas y rejillas Agilent Seahorse XF Mito Stress Test y Agilent SeaHorse xFe24 Islet Capture FluxPak (Agilent, 103418-100). Los islotes se recogieron a mano en pocillos que contenían 500 µl de medio de cultivo en cantidades suficientes para cubrir el 50 % del círculo interior de cada pocillo de muestra. La pantalla de captura de islotes se ajustó con cuidado y seguridad en la placa. Los islotes se lavaron dos veces con medio SeaHorse (SeaHorse XF DMEM) (Agilent, 103575-100) suplementado con piruvato 1 mM, glutamina 2 mM y glucosa 5,6 mM y se equilibró durante 1 h a 37 °C. Los reactivos de ensayo se cargaron en un cartucho de sensor previamente hidratado. La placa de ensayo se insertó en un analizador Agilent SeaHorse xFe24 calibrado y se realizó la prueba Mito Stress de acuerdo con el protocolo del fabricante con las siguientes concentraciones optimizadas de reactivos: islotes de ratón (5 µM de oligomicina, 1 µM de FCCP y 10 µM de rotenona y antimicina A ), islotes SC-beta (oligomicina A 10 µM, FCCP 2 µM y rotenona y antimicina A 10 µM), islotes humanos (oligomicina A 50 µM, FCCP 10 µM y rotenona y antimicina A 10 µM) e islotes porcinos (50 oligomicina A µM, FCCP 2,5 µM y rotenona y antimicina A 10 µM). Los valores de OCR se obtuvieron durante 200 min. Si la tasa de muestreo difería entre placas, el curso de tiempo se escalaba durante el período de observación estándar.

Para la normalización entre pocillos, los islotes de cada pocillo se lisaron en hidróxido de amonio 1 M + Triton X-100 al 0,2 %. El contenido de ADN se midió mediante el ensayo PicoGreen (Molecular Probes) utilizando controles de calibración estandarizados para la cuantificación en un lector de microplacas multimodo BioTek Synergy 2 (BioTek). Los parámetros de respiración celular individuales, incluidos OCR para la respiración basal, la producción de ATP, la fuga de protones, la respiración máxima, la capacidad respiratoria adicional y la respiración no mitocondrial, se calcularon y normalizaron con el contenido de ADN obtenido para los pocillos individuales.

Los grupos de islotes recibidos se incubaron en un matraz de cultivo dinámico a 70 rpm, 37 °C y 5 % de CO2 antes de realizar el ensayo. De acuerdo con el protocolo del fabricante, las células apoptóticas se tiñeron usando el kit de detección de apoptosis in situ con peroxidasa ApopTag (Millipore Sigma, S7100). Después de la tinción y el lavado, el portaobjetos se montó deshidratando con xileno y se aplicó un cubreobjetos utilizando medios de montaje. El número de células apoptóticas en cada islote se contó bajo un microscopio óptico.

Los grupos de islotes recibidos se incubaron en un matraz de cultivo dinámico a 70 rpm, 37 °C y 5 % de CO2 antes de realizar el ensayo. Luego, se diluyó el tampón de unión de anexina V 5x (Biotium, 99902) en agua desionizada para obtener el tampón de unión 1x. Los islotes se lavaron dos veces usando tampón de unión 1X. La solución de tinción se preparó diluyendo el conjugado de anexina V en tampón de unión 1x hasta una concentración final de 2,5 µg ml−1 y se incubó con los islotes a temperatura ambiente durante 15–30 min, protegidos de la luz. A continuación, los islotes se lavaron con tampón de unión 1X tres veces y se tomaron imágenes en 30 minutos utilizando el microscopio invertido confocal Olympus Fluoview 3000 con una excitación/emisión de 490/515 nm con un objetivo de 20X. La proteína de unión a fosfolípidos Ca2+ con una alta afinidad por la fosfatidilserina se cuantificó seleccionando la fluorescencia de mapeo de colores falsos utilizando el software Olympus CellSens Dimension (v1.17) y se analizó estadísticamente.

Se realizaron ensayos GSIS para evaluar la función in vitro de los islotes26. Brevemente, los islotes se lavaron dos veces en tampón Krebs Ringer (KRB) con bajo contenido de glucosa (glucosa 3,3 mM) (NaCl 128 mM, KCl 5 mM, CaCl2 2,7 mM, MgSO4 1,2 mM, Na2HPO4 1 mM, KH2PO4 1,2 mM, NaHCO3 5 mM, HEPES 10 mM y FAF-BSA al 0,1 % en agua desionizada). Luego, los islotes se cargaron en insertos transwell de 24 pocillos (Millicell, inserto de cultivo celular, PIXP01250) y se mantuvieron en ayunas en KRB con bajo contenido de glucosa durante 1 hora a 37 °C. Los islotes se lavaron una vez en KRB con bajo contenido de glucosa y luego se incubaron en KRB con bajo contenido de glucosa durante 1 ha 37 °C. El volumen de KRB con glucosa baja, glucosa alta y KCl fue de 1 ml por pocillo. Después de la incubación, el sobrenadante se recogió y almacenó a -20 °C hasta su análisis. Luego, los islotes se transfirieron a KRB con alto contenido de glucosa (16, 7 mM) durante 1 hora a 37 ° C, y el sobrenadante se recogió y almacenó. Luego, los islotes se transfirieron a KRB con bajo contenido de glucosa con KCl 30 mM para observar las condiciones de despolarización, se incubaron en este tampón durante 1 hora y se recogió el sobrenadante. Finalmente, los islotes se dispersaron mediante incubación con TrypLE y se contaron utilizando un contador de células automatizado Countess (Thermo Fisher Scientific). Los sobrenadantes recolectados se analizaron mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas para las concentraciones de insulina humana (ALPCO, 80-INSHUU-E01.1) y se normalizaron para el número de células. La insulina de los islotes de ratón se midió mediante el ensayo HTRF (fluorescencia homogénea resuelta en el tiempo) (Cisbio PerkinElmer, 62IN1PEG).

Los ratones C57BL/6 (machos de 6 a 8 semanas de edad, Charles River Laboratories) se volvieron diabéticos mediante una inyección intraperitoneal de una dosis única (220 mg kg−1) de estreptozotocina (Millipore Sigma, S0130). Los niveles de glucosa en sangre se midieron después de 4 a 7 días y la diabetes se confirmó mediante dos mediciones diarias sucesivas de >400 mg dl−1. Se realizaron trasplantes de islotes de masa marginal de 250 islotes por receptor51 debajo de la cápsula renal izquierda del ratón receptor. Para todos los grupos de tratamiento, los islotes se seleccionaron aleatoriamente para el trasplante, incluidos islotes de todos los tamaños, islotes morfológicamente alterados e intactos. Las mediciones de GS se realizaron diariamente. El éxito del trasplante se midió el primer día de dos mediciones diarias sucesivas de GS < 200 mg dl−1. El fracaso del injerto se definió como el primer día de dos mediciones consecutivas > 250 mg dl−1.

En el día 50 posterior al trasplante, se realizó IPGTT con ratones en ayunas durante 16 h (durante la noche) y luego inyectando 2,5 g kg−1 de glucosa por vía intraperitoneal y midiendo la GS cada 15 min durante 150 min.

Para confirmar que los islotes trasplantados controlaban los niveles de glucosa en sangre y no restauraban la función de las células beta nativas, se realizó una nefrectomía izquierda (incluido el injerto de islotes) para un subconjunto de trasplantes en el día 60 posterior al trasplante y se verificó el retorno de la hiperglucemia. Los explantes del día 60 se fijaron y tiñeron para insulina y glucagón.

Se trasplantaron islotes SC-beta y porcinos debajo de la cápsula renal de ratones macho (NSG) no diabéticos de 6 a 12 semanas de edad (Jackson Laboratory)21. En resumen, se inyectaron grupos de islotes que contenían un total de 5 × 106 células debajo de la cápsula renal de ratones NSG macho. Los ratones de control se sometieron a una cirugía simulada en la que se inyectó solución salina en la cápsula renal. Se realizaron sangrados faciales posteriores al trasplante en las semanas 4, 8 y 12 para medir los niveles de insulina humana. A las 14 semanas del trasplante, se realizó IPGTT modificado. Los ratones se mantuvieron en ayunas durante 16 h y se recolectó sangre antes y 30 min después de la inyección intraperitoneal de un bolo de glucosa de 2,5 g kg-1. El suero se separó de la sangre usando microvettes (Sarstedt, 20.1292.100), y la insulina humana se cuantificó usando el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas de insulina ultrasensible humana (ALPCO, 80-INSHUU-E01.1). Después de IPGTT, los riñones que contenían el injerto se explantaron y se tiñeron para insulina y glucagón.

Para los xenotrasplantes de islotes porcinos, se trasplantaron 350 islotes debajo de la cápsula renal de ratones NSG (macho o hembra, de 6 a 12 semanas de edad). A los 60 días después del trasplante, se extrajeron los riñones que contenían el injerto, se fijaron y se tiñeron para insulina y glucagón.

Los riñones recuperados con islotes trasplantados debajo de la cápsula renal se fijaron en formalina alcohólica al 70% (BBC Biochemical, 0460) y se incluyeron en bloques de parafina. Luego, se cortaron secciones de 5 µm usando un micrótomo. Las secciones se desparafinaron utilizando xileno y disminuyendo las concentraciones de EtOH al 100%, 90%, 80% y 70%. Los portaobjetos se incubaron con tampón de bloqueo (albúmina sérica bovina al 5 % (Millipore Sigma, B6917) en DPBS con Ca2+ y Mg2+ (Thermo Fisher Scientific, 14040141)) durante 20 min y luego se tiñeron con reactivos específicos de especies de la siguiente manera. Para los experimentos de viabilidad específicos de células beta, los islotes de ratón intactos se tiñeron con un colorante muerto vivo fijable (Biotium, Live-or-Dye NucFix) antes de la fijación, la permeabilización y la tinción con anticuerpos antiinsulina (ver más abajo).

Las secciones de riñón se incubaron a temperatura ambiente con anticuerpo anti-insulina de cobaya policlonal FLEX (Agilent, IR002) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las secciones se lavaron suavemente cinco veces usando el tampón de bloqueo y luego se incubaron con anticuerpo anti-glucagón de conejo recombinante (Abcam, ab92517) en tampón de bloqueo (1:570) durante 1 hora. A continuación, las secciones se lavaron suavemente cinco veces con tampón de bloqueo y se incubaron con anticuerpo secundario de inmunoglobulina G (IgG) (H+L) anti-cobaya de cabra (Alexa Fluor 488) (Abcam, ab150185; 1:250) y anti-conejo de cabra. IgG H&L (Alexa Fluor 647) (Abcam, ab150079) en tampón de bloqueo (1:250) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar suavemente las secciones con DPBS a 4 °C con Ca2+ y Mg2+, las secciones se etiquetaron con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (Millipore Sigma, F6057), se cubrieron con cubreobjetos (Chase Scientific, ZA0294) y se colocaron a 4 °C. durante 2 h antes de la toma de imágenes.

Las secciones de riñón se incubaron a temperatura ambiente con anticuerpo monoclonal de ratón antiinsulina (K36aC10) (Abcam, ab6995) en tampón de bloqueo (dilución 1:50) y anticuerpo recombinante de conejo antiglucagón (Abcam, ab92517) en tampón de bloqueo (dilución 1:570). ) durante 1 h a temperatura ambiente. Luego, las secciones se enjuagaron cinco veces suavemente con tampón de bloqueo y se incubaron con IgG H&L anti-ratón de cabra (Alexa Fluor 647) (Abcam, ab150115) en tampón de bloqueo (1:250) e IgG H&L anti-conejo de cabra (Alexa Fluor 488). (Abcam, ab150077) en tampón de bloqueo (1:300) durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar suavemente las secciones con DPBS a 4 °C con Ca2+ y Mg2+, las secciones se etiquetaron con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (Millipore Sigma, F6057), se cubrieron con cubreobjetos (Chase Scientific, ZA0294) y se mantuvieron a 4 °C. durante 2 h antes de obtener imágenes en un microscopio confocal invertido Olympus Fluoview 3000.

El análisis estadístico se realizó en R versión 4.0.3 (R Foundation for Statistical Computing). Incluimos el número exacto de experimentos independientes (n) y réplicas técnicas para cada figura relevante en la Tabla complementaria 3. La normalidad se probó con la prueba de Shapiro-Wilk para variables continuas o gráficamente usando diagramas qq e histogramas de distribución. La homogeneidad de la varianza se evaluó mediante la prueba de Levene. Para las comparaciones de grupos normales o casi normales, se utilizó la prueba ANOVA con la prueba Tukey HSD post hoc por parejas para determinar las diferencias estadísticas. Para grupos con varianza desigual se utilizó la prueba de Games-Howell. Las variables no normales se probaron mediante la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis para la significación general y la prueba de Wilcox (Mann-Whitney U) por pares para la comparación de grupos individuales. Los valores de p se ajustaron para comparaciones múltiples. El análisis del tiempo hasta el evento se realizó utilizando el método de Kaplan-Meier con la prueba de significación de rango logarítmico. Los datos se presentan como media ± sd a menos que se especifique lo contrario. El tratamiento estadístico completo para cada figura se presenta en los Datos complementarios 2. Las pruebas estadísticas fueron bilaterales y un valor de P de <0,05 se consideró significativo.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Todos los datos sin procesar se han archivado para acceso público (https://doi.org/10.13020/yrva-zr31)52.

Se utilizó R versión 4.0.3 para el análisis estadístico. Se utilizó MATLAB 2018b para calcular los cambios de volumen de los islotes a partir de los videos de contracción-hinchazón grabados experimentalmente. Se utilizó MATLAB 2019a para el ajuste de la curva de expansión y contracción y la evaluación de la función de costo de la toxicidad química. Los códigos personalizados están disponibles previa solicitud a los autores correspondientes.

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de Freitas, RC, Diller, KR, Lakey, JR & Rajotte, RV Comportamiento osmótico y propiedades de transporte de los islotes humanos en una solución de dimetilsulfóxido. Criobiología 35, 230–239 (1997).

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Cattral, MS, Lakey, JR, Warnock, GL, Kneteman, NM y Rajotte, RV Efecto de la crioconservación en la supervivencia y función de isoinjertos y aloinjertos de islotes murinos. Trasplante de células. 7, 373–379 (1998).

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Emmaullee, JA et al. El inhibidor selectivo de caspasa EP1013 aumenta la función del injerto de islotes humanos y la longevidad en el trasplante de islotes de masa marginal en ratones. Diabetes 57, 1556–1566 (2008).

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Bischof, John C; Finger, Erik B. Cryopreservation of Pancreatic Islets Experimental Data Repository 2022. Obtenido del Repositorio de datos de la Universidad de Minnesota, https://doi.org/10.13020/yrva-zr31 (2022).

Descargar referencias

JSR recibió el apoyo del Instituto de Diabetes Schulze y la División de Trasplantes del Departamento de Cirugía de la Universidad de Minnesota. Los autores agradecen a F. Zhou y W. Zhang del Centro de Caracterización de la Universidad de Minnesota por su ayuda con TEM y a C. Forster y A. Lewis del Instituto de Ciencias Clínicas y Traslacionales de la Universidad de Minnesota por su asistencia técnica con los experimentos de histología. Los autores agradecen al Instituto de Diabetes Schulze, Departamento de Cirugía por el uso de su microscopio confocal y por proporcionar islotes porcinos. Este trabajo cuenta con el apoyo de subvenciones de Regenerative Medicine Minnesota (EBF y JCB), la Fundación Nacional de Ciencias (EEC 1941543, JCB y EBF) y los Institutos Nacionales de Salud (R01DK131209, JCB y EBF; R01DK117425, JCB y EBF; y R01HL135046, JCB y EBF). LZ reconoce la Beca de Disertación Doctoral de la Universidad de Minnesota, y JCB reconoce el apoyo de la Cátedra Kuhrmeyer en Ingeniería Mecánica y la Cátedra Bakken en el Instituto de Ingeniería en Medicina de la Universidad de Minnesota. PPQ desea agradecer a la Fundación JW Kieckhefer, la familia Stephen y Barbara Slaggie y la Fundación Khalifa Bin Zayed Al Nahyan por apoyar este trabajo.

Estos autores contribuyeron igualmente: Li Zhan, Joseph Sushil Rao.

Estos autores supervisaron conjuntamente este trabajo: John C. Bischof, Erik B. Finger.

Departamento de Ingeniería Mecánica, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN, EE. UU.

Li Zhan, Zonghu Han, Michael Etheridge, Cari S. Dutcher y John C. Bischof

Departamento de Cirugía, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN, EE. UU.

Joseph Sushil Rao, Diane Tobolt y Erik B. Finger

Instituto de Diabetes Schulze, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN, EE. UU.

José Sushil Rao

Departamento de Ingeniería Química y Ciencia de los Materiales, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN, EE. UU.

Nikhil Sethia y Cari S. Dutcher

Departamento de Fisiología e Ingeniería Biomédica, Mayo Clinic, Rochester, MN, EE. UU.

Michael Q. Slama y Quinn P. Peterson

Centro de Medicina Regenerativa, Mayo Clinic, Rochester, MN, EE. UU.

Quinn P Peterson

Departamento de Ingeniería Biomédica, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN, EE. UU.

Juan C Obispo

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LZ, JSR, JCB y EBF concibieron y diseñaron el estudio. LZ, JSR, NS, MQS y DT realizaron experimentos y reunieron los datos. ZH, NS y LZ realizaron el modelado y ensamblaron los datos. CSD, QPP, JCB y EBF coordinaron y supervisaron el estudio. JCB y EBF son los coautores principales. Todos los autores participaron en la discusión e interpretación de los datos. LZ, JCB y EBF escribieron el manuscrito con aportes de todos los autores.

Correspondencia a Erik B. Finger.

LZ, JSR, ZH, NS, ME, CSD, JCB y EBF han presentado una solicitud de patente provisional (número de serie 63/270,192) relevante para este estudio.

Nature Medicine agradece a Gordon Weir, Klearchos Papas y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Jerome Staal y Jennifer Sargent fueron los principales editores de este artículo y gestionaron su proceso editorial y revisión por pares en colaboración con el resto del equipo editorial.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Resultados complementarios y discusión, métodos, figuras 1 a 12, tablas 1 a 3 y referencias.

Vídeo de alta velocidad (4000 fotogramas por segundo) de nanocalentamiento láser (pulso láser de 7,5 ms) de una gota de 2 μl encapsulada con islotes.

Resumen del tratamiento estadístico para cada figura, incluidos los valores de P, las estadísticas de prueba y los intervalos de confianza.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Zhan, L., Rao, JS, Sethia, N. et al. La criopreservación de islotes pancreáticos por vitrificación logra una alta viabilidad, función, recuperación y escalabilidad clínica para el trasplante. Nat Med 28, 798–808 (2022). https://doi.org/10.1038/s41591-022-01718-1

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Recibido: 24 Septiembre 2021

Aceptado: 26 de enero de 2022

Publicado: 14 de marzo de 2022

Fecha de emisión: abril de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41591-022-01718-1

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