Seguridad e inmunogenicidad de un termoestable ID93 + GLA

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 1138 (2023) Citar este artículo

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Las vacunas de subunidades que contienen adyuvantes representan un enfoque prometedor para la protección contra la tuberculosis (TB), pero los candidatos actuales requieren almacenamiento refrigerado. Aquí presentamos los resultados de un ensayo clínico de fase 1 aleatorizado y doble ciego (NCT03722472) que evalúa la seguridad, la tolerabilidad y la inmunogenicidad de una presentación de un solo vial liofilizado termoestable de la vacuna candidata ID93 + GLA-SE en comparación con las dos no termoestables. -Presentación de vacuna en vial en adultos sanos. Los participantes fueron monitoreados para los criterios de valoración primarios, secundarios y exploratorios después de la administración intramuscular de dos dosis de vacuna con 56 días de diferencia. Los puntos finales primarios incluyeron la reactogenicidad local y sistémica y los eventos adversos. Los criterios de valoración secundarios incluyeron anticuerpos específicos de antígeno (IgG) y respuestas inmunitarias celulares (células mononucleares de sangre periférica productoras de citoquinas y células T). Ambas presentaciones de vacunas son seguras y bien toleradas y provocan anticuerpos séricos específicos de antígeno robustos y respuestas inmunitarias celulares de tipo Th1. En comparación con la presentación no termoestable, la formulación de vacuna termoestable genera mayores respuestas de anticuerpos séricos (p < 0,05) y más células secretoras de anticuerpos (p < 0,05). En este trabajo, mostramos que la vacuna candidata termoestable ID93 + GLA-SE es segura e inmunogénica en adultos sanos.

La tuberculosis (TB) es una de las principales causas infecciosas de morbilidad y mortalidad, ya que mató a 1,5 millones de personas y provocó 10 millones de nuevas infecciones en todo el mundo en 2020. Dos tercios de los nuevos casos se producen en ocho países (India, China, Indonesia, Filipinas, Pakistán, Nigeria, Bangladesh y Sudáfrica)1. Durante más de 100 años, solo se ha distribuido ampliamente una vacuna para la prevención de la enfermedad de tuberculosis (Bacillus Calmette-Guérin, o BCG). Esta vacuna tiene una eficacia limitada en la prevención de la enfermedad de TB, siendo más útil para la prevención de la meningitis tuberculosa y la enfermedad miliar en niños pequeños2. La eficacia de la vacuna en adultos o para la prevención de enfermedades pulmonares es más modesta3 y, en ocasiones, la disponibilidad de BCG es limitada4.

Los esfuerzos para desarrollar nuevas vacunas contra la TB se han basado en la mayoría de los casos en la selección racional de antígenos que se vuelven más inmunogénicos mediante la combinación con adyuvantes de vacunas5. El campo del desarrollo de vacunas contra la TB con subunidades adyuvadas se ha visto impulsado por la eficacia de ~50 % lograda con el candidato M72/AS01E en las pruebas clínicas de fase 2b6. También se encuentran en desarrollo clínico otras vacunas candidatas contra la TB de subunidades que contienen adyuvantes7. Por ejemplo, ID93 + GLA-SE demostró una seguridad e inmunogenicidad prometedoras en las pruebas clínicas de Fase 2a8. A pesar de tal progreso, no se encuentran en desarrollo clínico candidatos a vacunas termoestables contra la TB con subunidades adyuvadas. Teniendo en cuenta la enorme carga mundial de TB, particularmente en el sudeste asiático y el África subsahariana, una vacuna termoestable podría proporcionar ventajas sustanciales para la distribución mundial de vacunas9.

Se pueden emplear varias tecnologías para aumentar la termoestabilidad de las vacunas10,11. Sin embargo, la adaptación de tecnologías termoestables para vacunas que contienen adyuvantes agrega una complejidad sustancial11. Por ejemplo, a menudo se emplean tecnologías de secado como la liofilización o el secado por aspersión para mejorar la estabilidad de las vacunas. Sin embargo, mantener la estructura de partículas inherente a la actividad de muchas formulaciones de adyuvantes de vacunas, incluidas las emulsiones y las sales de aluminio, requiere enfoques de caracterización y desarrollo de procesos únicos. Anteriormente describimos el diseño de la formulación, el desarrollo del proceso y la fabricación de una formulación liofilizada de la vacuna candidata contra la tuberculosis con subunidades adyuvada en emulsión ID93 + GLA-SE que mantuvo la estabilidad durante 3 meses cuando se almacenó a 37 °C12,13.

Aquí, presentamos los resultados de un ensayo clínico de Fase 1, aleatorizado, doble ciego, diseñado para evaluar la seguridad, la tolerabilidad y la inmunogenicidad de este candidato a vacuna ID93 + GLA-SE liofilizado de un solo vial en comparación con la presentación de dos viales desarrollada previamente en sujetos adultos sanos. Mostramos que la presentación de un solo vial termoestable de ID93 + GLA-SE obtiene un perfil de seguridad similar y un perfil de inmunogenicidad comparable o mejorado con la presentación de vacuna de dos viales no termoestables.

La participación de sujetos humanos en el estudio se produjo a partir del reclutamiento del 29 de octubre de 2018 hasta el seguimiento, que finalizó el 15 de junio de 2020. Se evaluó un total de 93 participantes para su inclusión en el estudio durante un período de reclutamiento de 6 meses, entre los cuales 48 cumplieron criterios de ingreso al estudio y fueron aleatorizados 1:1 en dos grupos de tratamiento (Fig. 1). Entre las 45 fallas de detección, las razones más comunes para la exclusión fueron valores de laboratorio de detección que no estaban dentro del rango normal, otras condiciones médicas, falta de buena salud general e incumplimiento del protocolo (Fig. 1). Los 48 participantes inscritos recibieron al menos una inyección (población de seguridad), 45 participantes recibieron ambas inyecciones y 44 participantes completaron el estudio de acuerdo con el plan (población por protocolo). Entre los tres participantes que solo recibieron la primera inyección del estudio en el Grupo de tratamiento 2 (vacuna contra la tuberculosis no termoestable), dos se perdieron durante el seguimiento y uno dejó de ser elegible debido a un requisito laboral de inmunización con otra vacuna. Las muestras de los participantes que recibieron solo una inyección del estudio se incluyeron en el análisis de datos de inmunogenicidad antes del día 56 del estudio, después de lo cual solo las muestras de los participantes que recibieron ambas inyecciones del estudio se incluyeron en el análisis de inmunogenicidad. Un participante adicional del estudio se retiró voluntariamente del estudio después del día 70 del estudio. Un total de 45 participantes completaron la visita de seguimiento a largo plazo el día 421 del estudio (44 recibieron ambas inyecciones y 1 recibió una inyección). Otras desviaciones del protocolo, como visitas y/o procedimientos perdidos, se describen en la Información complementaria. La Tabla 1 resume las características demográficas y otras características iniciales de los participantes incluidos en la población de seguridad (n = 48). Treinta y seis de los 48 participantes (75%) eran mujeres y 12 (25%) eran hombres. Las edades de los participantes en el momento de la inscripción oscilaron entre 18 y 48 años, con una mediana de 23 años. El índice de masa corporal (IMC) medio de los participantes fue de 24,1. Las razas incluyeron 43 (90 %) blancas, 2 (4 %) asiáticas, 2 (4 %) mixtas y 1 (2 %) negra o afroamericana.

De 93 sujetos examinados, 48 ​​cumplieron con los criterios del estudio y se inscribieron y asignaron al azar a dos grupos de tratamiento. El Grupo de tratamiento 1 comprendió a 23 participantes que recibieron la vacuna ID93 + GLA-SE termoestable de un solo vial; El grupo de tratamiento 2 comprendía 25 participantes que recibieron la vacuna ID93 + GLA-SE de dos viales no termoestables. La población de seguridad representa a los participantes que reciben al menos una inyección. La población por protocolo representa a los participantes que completaron el estudio de acuerdo con el plan.

Se determinó que ambas presentaciones de la vacuna ID93 + GLA-SE eran seguras y bien toleradas en participantes adultos sanos luego de la administración intramuscular (IM). El patrón, el tipo, la gravedad y la frecuencia de los eventos adversos (EA) fueron similares en ambos grupos de tratamiento. La Tabla 2 resume la proporción de participantes con EA por gravedad, relación con la inyección del estudio y grupo de tratamiento. Se informaron EA en el 98 % de todos los participantes del estudio. Los grados más altos informados para los EA fueron Grado 1 en el 96 % y el 92 % o Grado 2 en el 22 y el 36 % de los participantes en los Grupos de tratamiento 1 y 2, respectivamente. No se informaron EA de grado 3 o 4, eventos adversos graves (SAE) o posibles afecciones médicas inmunomediadas (PIMMC). La reactogenicidad local y sistémica fue común. La mayoría de los participantes informaron dolor o sensibilidad en el lugar de la inyección, con fatiga, dolor de cabeza y mialgia como los efectos sistémicos más comunes. Las infecciones de las vías respiratorias superiores o la disminución de la hemoglobina en algunos participantes no se consideraron relacionadas con el tratamiento (Información complementaria, Protocolo del estudio). La mayoría de los EA se resolvieron sin tratamiento y ningún participante se retiró debido a un EA. Por lo tanto, se determinó que la presentación termoestable de un solo vial de la vacuna candidata ID93 + GLA-SE era igualmente segura y bien tolerada en comparación con la presentación de la vacuna no termoestable de dos viales a la dosis administrada en adultos sanos.

Las respuestas de anticuerpos IgG a ID93 se evaluaron en cada grupo de tratamiento. Se realizaron ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) de anticuerpos IgG séricos en muestras recolectadas en los días de estudio 0, 14, 56, 70, 84 y 224 para IgG, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 totales. También se evaluó la IgG total para las proteínas de subunidades que comprenden ID93 (Rv1813, Rv2608, Rv3619 y Rv3620). Los niveles séricos de anticuerpos IgG específicos de ID93 se presentan como título de punto final medio (MEPT), junto con la tasa de respuesta y el cambio de veces para IgG total, por régimen de tratamiento (Fig. 2a-g y Tabla complementaria 1). Los participantes en ambos grupos de tratamiento ID93 + GLA-SE desarrollaron respuestas sólidas de anticuerpos específicos de ID93 con antecedentes de bajo nivel detectados al inicio del estudio. Las respuestas de IgG específicas de ID93 permanecieron elevadas durante 6 meses después de la última vacunación en ambos regímenes. Las respuestas IgG1 e IgG3 específicas de ID93 fueron más altas que las respuestas IgG2 e IgG4. Las respuestas de IgG total específicas de la subunidad ID93 fueron mayores para Rv1813, seguido de Rv2608, Rv3620 y Rv3619 (Figura 1 complementaria). En todos los casos, las respuestas máximas de anticuerpos se observaron después de la segunda inyección. Las tasas de respuesta para la IgG total específica de ID93, basadas en un aumento de cuatro veces desde el inicio, fueron del 90 al 100 % en los días 70 y 84 del estudio para ambos grupos de tratamiento (Fig. 2a). En el día 224 del estudio, las tasas de respuesta de IgG oscilaron entre el 63 % y el 85 % (Fig. 2a). La comparación de la presentación termoestable de un solo vial con la presentación no termoestable de dos viales mostró que el formato termoestable provocó una respuesta de anticuerpos significativamente mayor en múltiples lecturas en los puntos de tiempo pico. Por ejemplo, en comparación con la presentación de dos viales no termoestables, la formulación termoestable de un solo vial mejoró el cambio de IgG específico de ID93 (190,5 frente a 33,0 en el día de estudio 70 [p = 0,0023] y 97,4 frente a 32,2 en el día de estudio 84 [p = 0,0495]) (Fig. 2b) y el MEPT IgG específico de ID93 (10868 frente a 2583 en el día de estudio 70 [p = 0,0061]) (Fig. 2c).

n = 20–25 muestras biológicamente independientes según el grupo de tratamiento y el punto temporal, consulte la Tabla complementaria 1. a La tasa de respuesta de anticuerpos séricos se calculó como un aumento de al menos cuatro veces en la IgG específica de ID93 desde el valor inicial medido por ELISA. Las tasas de respuesta se compararon mediante la prueba exacta de Fisher. Las diferencias se detectaron en base a una prueba bilateral y p ≤ 0,05 (α = 0,05) con ajuste de Bonferroni para tener en cuenta los múltiples puntos temporales. b–i Los datos se compararon entre los dos grupos de tratamiento utilizando la prueba de suma de rangos de Wilcoxon con el ajuste de Bonferroni para tener en cuenta los múltiples puntos de tiempo. b Cambios en el número de veces en IgG total específica de ID93 en suero desde el inicio según lo medido por ELISA. **p = 0,0023 (Día de estudio 70), *p = 0,0495 (Día de estudio 84). c Gráfico longitudinal del grupo MEPT para IgG total específica de ID93 en suero medido por ELISA. **p = 0,0061. d-g Gráficas longitudinales de subclases de IgG específicas de MEPT ID93 del grupo en suero medidas por ELISA. IgG1. **p = 0,0032 (Día de estudio 70), **p = 0,0040 (Día de estudio 84). e IgG2. fIgG3. g IgG4. h Enumeración de células secretoras de IgG específicas de ID93 en muestras de PBMC medidas mediante el ensayo ELISpot. **p = 0,0085. i Enumeración de células B de memoria IgG específicas de ID93 en muestras de PBMC según lo medido por el ensayo ELISpot. Los valores medios se representan mediante símbolos y las barras de error muestran el IC del 95 % de la media. Los asteriscos indican una diferencia estadísticamente significativa (*p < 0,05, **p < 0,01) entre los grupos de tratamiento en ese momento después de la corrección para comparaciones múltiples. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Las células secretoras de anticuerpos IgG específicas de ID93 en muestras de PBMC se evaluaron mediante inmunospot ligado a enzimas (ELISpot) en los días de estudio 0, 7, 56 y 63. Aunque las respuestas se mantuvieron cerca de los niveles iniciales en la mayoría de los puntos de tiempo en ambos grupos de tratamiento, el aumento en el número de células secretoras de anticuerpos IgG específicos de ID93 en el grupo de vacuna termoestable de un solo vial se midió en el día 63 del estudio, mientras que la respuesta en el grupo de vacuna no termoestable de dos viales se mantuvo baja (Fig. 2h). ELISpot también midió las células B de memoria IgG específicas de ID93 en muestras de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en los días de estudio 0, 56, 84 y 224. Las células B de memoria IgG parecieron aumentar en ambos grupos de tratamiento 4 semanas después del segundo inyección, pero las respuestas habían regresado a los niveles iniciales para el día de estudio 224 (Fig. 2i). Por lo tanto, de acuerdo con el patrón evidente en las respuestas de IgG séricas descritas anteriormente, la presentación de vacuna termoestable de un solo vial aumentó significativamente las células plasmáticas secretoras de IgG específicas de ID93 en comparación con la presentación de dos viales no termoestables después de la segunda inmunización.

Las respuestas de IgA específicas para ID93 de la mucosa se evaluaron mediante ELISA utilizando hisopos nasales y muestras de lágrimas en los días de estudio 0, 70 y 224. Sin embargo, la respuesta de IgA específica para ID93 en las muestras de mucosas se mantuvo en los niveles iniciales en todos los puntos temporales en ambos grupos de tratamiento ( Figura complementaria 2a, b). Del mismo modo, las células secretoras de anticuerpos IgA específicas de ID93 y las células B de memoria IgA en las muestras de PBMC no aumentaron significativamente por encima de los niveles iniciales (Fig. 2c, d complementarias). Por lo tanto, ninguno de los grupos de tratamiento pareció provocar respuestas de anticuerpos IgA específicos de antígeno en las muestras mucosas o en las PBMC.

Para cuantificar el número de células secretoras de citoquinas IFN-γ e IL-10 en muestras de PBMC en respuesta a ID93, se realizaron ensayos ELISpot en muestras recolectadas en los días de estudio 0, 14, 56, 70, 84 y 224. IFN-γ las tasas de respuesta, según el análisis de MIMOSA, alcanzaron su punto máximo después de la segunda inyección en 70–76 % en el día 70 del estudio para ambos grupos de tratamiento (Fig. 3a). En el día de estudio 224, las tasas de respuesta de IFN-γ variaron del 53 al 65 % (Fig. 3a). Los participantes en ambos grupos de tratamiento ID93 + GLA-SE desarrollaron respuestas sólidas de recuperación de PBMC de IFN-γ específicas de ID93, medidas por SFU total por millón de PBMC que producen IFN-γ (Tabla complementaria 2 y Fig. 3b). Estas respuestas se mantuvieron durante 6 meses después de la última vacunación en ambos regímenes. Por otro lado, se observó una baja reactividad a ID93 en las células productoras de IL-10 (Tabla complementaria 3 y Fig. 3c, d). Este patrón de números aumentados de células excretoras de IFN-γ y niveles bajos de células excretoras de IL-10 es indicativo de una respuesta inmunitaria de tipo Th1. Una comparación de las dos presentaciones de vacuna no mostró diferencias significativas, aunque el formato de vacuna termoestable de un solo vial tendió a provocar respuestas de mayor magnitud. Los niveles de IFN-γ e IL-10 de las PBMC estimuladas por grupos de péptidos de la subunidad ID93 siguieron patrones similares a los descritos anteriormente para las PBMC estimuladas con ID93, pero en magnitudes más bajas (Fig. 3 complementaria).

n = 16–25 muestras biológicamente independientes según el grupo de tratamiento y el momento, consulte las tablas complementarias 2–4. una tasa de respuesta de IFN-γ mediante el ensayo ELISpot utilizando PBMC estimuladas con ID93 y calculada por MIMOSA como un cambio desde el valor inicial utilizando SFU sustraídas de fondo. b Recuento de células secretoras de IFN-γ estimuladas por ID93 en muestras de PBMC según lo medido por el ensayo ELISpot. c Tasa de respuesta de IL-10 por ensayo ELISpot usando PBMC estimuladas con ID93 y calculada por MIMOSA como un cambio desde el valor inicial usando SFU sustraídas de fondo. d Enumeración de células secretoras de IL-10 estimuladas con ID93 en muestras de PBMC según lo medido por el ensayo ELISpot. e Tasa de respuesta por ICS de células T CD4+ que expresan cualquiera de las dos citocinas entre CD154, TNF, IFN-γ, IL-2, IL-21 e IL-4 calculada por MIMOSA como un cambio desde el inicio utilizando frecuencias sustraídas de fondo y recuentos totales . f Frecuencias de células T CD4+ estimuladas con ID93 que expresan Cualquiera de las dos citoquinas en muestras de PBMC medidas por ICS. g Fenotipo de linfocitos T CD4+ de citocina única y citocina polifuncional en los días 70 y 84 del estudio según lo medido por ICS. Proporciones de células T CD4+ estimuladas con ID93 que expresan diferentes citocinas individuales y combinaciones de citocinas en los días de estudio 70 y 84 representadas por frecuencias medianas. El área del gráfico circular es proporcional a las frecuencias medias totales de cada lectura. a, c, e Los gráficos de tasa de respuesta muestran los valores medios representados por símbolos, y las barras de error muestran el IC del 95 % en la media. Las tasas de respuesta se compararon mediante la prueba exacta de Fisher. Las diferencias se detectaron en base a una prueba bilateral y p ≤ 0,05 (α = 0,05) con ajustes de Bonferroni para tener en cuenta los múltiples puntos temporales. b, d, f Los diagramas de puntos representan todos los valores sustraídos de fondo como símbolos, con líneas continuas que representan valores medianos y barras de error que representan el rango intercuartílico. Se compararon los datos entre los dos grupos de tratamiento utilizando la prueba de suma de rangos de Wilcoxon con el ajuste de Bonferroni para tener en cuenta los múltiples puntos de tiempo. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

El porcentaje de células T CD4+ y CD8+ que producen dos o más citoquinas en respuesta a ID93 se midió mediante tinción de citoquinas intracelulares (ICS) con citometría de flujo usando muestras de PBMC recolectadas en los días de estudio 0, 7, 14, 56, 63, 70, 84, y 224. La tasa de respuesta y las frecuencias de las células T CD4+ específicas de antígeno que expresan dos o más citoquinas (es decir, células que expresan dos o más marcadores inmunitarios entre IFN-γ, TNF, IL-2, IL-4, IL-21, y CD154) se calcularon utilizando valores sustraídos de fondo. Se observaron respuestas de células T CD4+ específicas de ID93 con ambas presentaciones de vacunas (Tabla complementaria 4 y Fig. 3e, f). Las tasas de respuesta máximas (analizados por MIMOSA) ocurrieron en el día 70 del estudio en ambos grupos de tratamiento (38–59 %) (Fig. 3e). Las tasas de respuesta persistieron en un 26-31 % en el día de estudio 224, 6 meses después de la última inyección del estudio (Fig. 3e). El análisis de perfiles de citoquinas individuales y combinados de células T específicas de ID93 indicó que las frecuencias más altas de expresión se atribuyeron a IFN-γ, TNF y/o IL-2, con una respuesta baja de IL-4 (Fig. 3g). Mientras que la formulación de la vacuna termoestable tendía a provocar una frecuencia media más alta de la respuesta del TNF, ambas presentaciones de la vacuna inducían una respuesta inmunitaria polifuncional y sesgada hacia Th1. Sin embargo, se observaron impactos mínimos de cualquiera de los tratamientos en las frecuencias de respuesta específicas de ID93 de las células T CD8 + (Figura complementaria 4d y Tabla complementaria 5). En resumen, aunque las diferencias en las lecturas individuales no fueron estadísticamente significativas, la presentación de vacuna termoestable mostró una tendencia general de mayores frecuencias de respuesta de citocinas de células T CD4+ en comparación con la presentación de vacuna no termoestable.

La frecuencia de otros subtipos de células T, incluidas las células T auxiliares foliculares (Tfh), las células T efectoras de memoria y las células T de memoria central, así como otras células inmunitarias, incluidas las células asesinas naturales (NK) y las células T NK, se midió mediante ICS con citometría de flujo en muestras de PBMC. Ambos tratamientos mejoraron las frecuencias de las células de memoria central CD4+ T, pero no las frecuencias de las células de memoria efectoras en comparación con la línea de base (Fig. 4a, b complementarias). La presentación termoestable de un solo vial también provocó un aumento modesto en las frecuencias de las células Tfh en el día 63 del estudio en comparación con el valor inicial (Fig. 4c complementaria). Sin embargo, se observaron efectos mínimos de cualquiera de los tratamientos en las frecuencias de respuesta específicas de ID93 de las células NK o las células T NK (Figura complementaria 4e, f).

Finalmente, la inhibición neta del crecimiento de micobacterias intracelulares de cada tratamiento se midió utilizando muestras de sangre total recolectadas en los días de estudio 0, 70 y 224. Sin embargo, ninguna presentación de vacuna mejoró la inhibición del crecimiento de micobacterias como lo indica el tiempo hasta la positividad (Figura 5 complementaria).

Hasta donde sabemos, este estudio representa el primer candidato a vacuna contra la tuberculosis de subunidades termoestables que se evalúa en pruebas clínicas11,14. Para otras indicaciones de enfermedades, tres candidatas a vacunas de subunidades con adyuvante liofilizado han ingresado a pruebas clínicas, pero los resultados clínicos solo se han publicado para una candidata sin evaluar sus posibles características de termoestabilidad15,16,17,18. Por lo tanto, el presente informe representa un gran paso adelante en el campo de los candidatos a vacunas termoestables liofilizadas que contienen adyuvantes. En particular, algunas formulaciones de vacunas líquidas con propiedades termoestables han progresado en las pruebas clínicas e incluso en la obtención de la licencia, con un impacto beneficioso significativo debido a su perfil de termoestabilidad demostrado en el uso de campo11,19,20. Sin embargo, la estabilidad de tales vacunas fuera de las temperaturas de refrigeración generalmente se limita a días o algunas semanas, mientras que la presentación termoestable de un solo vial de ID93 + GLA-SE es estable durante 3 meses a 37 °C12,13.

Los objetivos específicos del ensayo de fase 1 actual eran evaluar la seguridad y la inmunogenicidad de una presentación termoestable de un solo vial de la vacuna candidata ID93 + GLA-SE en comparación con la presentación de dos viales no termoestables desarrollada anteriormente. Los perfiles de seguridad demostrados aquí para ambas presentaciones de vacuna fueron consistentes con la reactogenicidad generalmente leve evidente en ensayos clínicos previos de la presentación de vacuna de dos viales8,21,22. El dolor en el lugar de la inyección fue el AA más común, y no se identificaron AA o SAE de Grado 3 o 4 para ninguna presentación de vacuna. Así, la presentación de la vacuna termoestable mantuvo el excelente perfil de seguridad del candidato vacunal no termoestable ID93 + GLA-SE.

Una respuesta de células T de tipo Th1 se considera favorable para la protección contra Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis)23. Se demostró previamente que la presentación no termoestable de dos viales ID93 + GLA-SE induce respuestas sólidas de células T CD4+ de tipo Th1 y IgG específicas de antígeno8,21,22. Los resultados de inmunogenicidad informados aquí para ambas presentaciones de vacunas fueron consistentes con este perfil, incluidas las células T CD4+ polifuncionales que expresan IFN-γ, TNF e IL-2. Sin embargo, las lecturas múltiples empleadas en el ensayo actual no se habían incluido en las evaluaciones clínicas anteriores de ID93 + GLA-SE, incluidos los ELISA de anticuerpos de secreción de la mucosa, el ensayo de inhibición del crecimiento de M. tuberculosis en sangre total y la enumeración ELISpot de células T y células B. Si bien fue evidente un impacto mínimo de cualquiera de las presentaciones de la vacuna en las respuestas de anticuerpos de la mucosa o la inhibición del crecimiento de M. tuberculosis en sangre completa, la enumeración basada en ELISpot de células productoras de citoquinas en muestras de PBMC estimuladas con ID93 indicó que ambas presentaciones de ID93 + GLA-SE provocó una respuesta sólida de IFN-γ y una respuesta baja de IL-10, lo que es consistente con la calidad de respuesta de tipo Th1 evidente en los datos de ICS de los ensayos actuales y anteriores. Curiosamente, se observó una tendencia general de respuestas máximas de células T de mayor magnitud en el grupo de tratamiento termoestable con un solo vial en comparación con el grupo de tratamiento no termoestable.

Si bien las respuestas de células B y anticuerpos no son suficientes para la eficacia protectora contra la TB, sus múltiples funciones complementarias a la inmunidad mediada por células T se aprecian cada vez más, y se justifica una mayor investigación clínica a este respecto24,25,26. Sorprendentemente, la presentación termoestable de vacuna de un solo vial provocó significativamente más IgG e IgG1 específicas de antígeno en el suero recolectado de 2 a 4 semanas después de la segunda inmunización que la presentación de dos viales no termoestables. Además, la enumeración de células secretoras de IgG específicas de ID93 en muestras de PBMC reveló una respuesta sólida 1 semana después de la segunda inmunización para la presentación de vacuna termoestable de un solo vial, pero no para la presentación de dos viales no termoestables. No está claro cómo atribuir específicamente las diferencias inesperadas en la magnitud de las respuestas inmunitarias entre los grupos de tratamiento. Un MEPT de línea de base más alto podría afectar los cálculos de cambio de veces después de la vacunación, pero esto no explica las diferencias en los valores absolutos de MEPT. Si bien cada grupo de tratamiento recibió la misma dosis de antígeno y adyuvante, otros factores, incluida la composición del excipiente, la fecha de fabricación y los procesos de fabricación, diferían necesariamente.

Los múltiples ensayos inmunológicos, tipos de muestras y puntos de tiempo empleados en este estudio representan la evaluación de inmunogenicidad clínica más completa de la vacuna candidata ID93 + GLA-SE en adultos sanos hasta la fecha. No obstante, el estudio tuvo varias limitaciones, incluida la falta de grupos de tratamiento con placebo, pero estos se consideraron innecesarios debido a la evaluación clínica previa de ID93 + GLA-SE en comparación con ID93 solo o placebo con solución salina8,22. Otras limitaciones incluyen que no existen correlatos inmunológicos establecidos de protección contra la TB y que los participantes no fueron vacunados con BCG ni preexpuestos a M. tuberculosis. Por lo tanto, no es posible predecir cómo el perfil de inmunogenicidad de ID93 + GLA-SE, y particularmente las respuestas mejoradas provocadas por la formulación de vacuna termoestable, se traducirían en impactos sobre la eficacia protectora. Finalmente, este estudio también inscribió principalmente a mujeres blancas, lo que dificulta las extrapolaciones a otras poblaciones con una alta carga de enfermedad de TB.

El impacto de la formulación termoestable de un solo vial de ID93 + GLA-SE en la escalabilidad y el costo de la fabricación de vacunas es otra consideración importante. Estimamos que el costo del excipiente en la presentación termoestable sería de aproximadamente $0.15 más por dosis que la composición no termoestable a escala comercial. Además, los costos adicionales estarían asociados con el tiempo de procesamiento de liofilización de varios días. Sin embargo, estos costos incrementados podrían ser mitigados por los ahorros de costos anticipados y la reducción de desperdicios asociados con los requisitos de almacenamiento menos estrictos de la formulación termoestable en comparación con la presentación no termoestable. Además, la liofilización ya es una técnica de procesamiento farmacéutico bien establecida que se emplea en la producción de muchas vacunas autorizadas.

En resumen, esta evaluación clínica de Fase 1 indicó que la presentación de un solo vial termoestable de ID93 + GLA-SE genera un perfil de seguridad similar y un perfil de inmunogenicidad comparable o mejorado a la presentación de vacuna de dos viales no termoestables. Una vacuna termoestable eficaz contra la TB tendría implicaciones importantes para el impacto en la salud mundial. Además, este estudio demuestra una prueba de concepto de que una vacuna que contiene adyuvante se puede formular en una presentación termoestable de un solo vial sin afectar negativamente la inmunogenicidad clínica o las características de seguridad.

Este estudio fue un ensayo clínico de Fase 1, aleatorizado, doble ciego, diseñado para evaluar la seguridad, la tolerabilidad y la inmunogenicidad de ID93 + GLA-SE liofilizado de un solo vial termoestable en comparación con la presentación de dos viales no termoestables que consta de ID93 liofilizado y líquido GLA-SE administrado como dos inyecciones IM en participantes adultos sanos. El estudio se realizó bajo un nuevo fármaco en investigación (IND) con la Administración de Drogas y Alimentos de los EE. UU. (FDA), y el protocolo, el formulario de consentimiento informado y otros materiales del estudio fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Saint Louis. El ensayo clínico está registrado en ClinicalTrials.gov con el identificador NCT03722472.

El estudio se llevó a cabo en un solo lugar (Centro para el Desarrollo de Vacunas de la Universidad de Saint Louis en St. Louis, MO) y reclutó a participantes de St. Louis, Missouri y sus alrededores. Se inscribió un total de 48 participantes masculinos y femeninos de 18 a 55 años y en general con buena salud, según lo planificado por el Protocolo del estudio (Información complementaria). Los participantes fueron asesorados sobre el estudio y se sometieron al proceso de consentimiento informado. La evaluación incluyó una evaluación del historial médico, historial de medicamentos, un examen físico, pruebas de laboratorio de seguridad y análisis de orina. Los criterios completos de inclusión y exclusión se muestran en Información complementaria (Protocolo de estudio). Los criterios de elegibilidad incluyeron hombres y mujeres sanos de 18 a 55 años de edad con virus de inmunodeficiencia humana (VIH), antígeno de superficie de hepatitis B (HBsAg) y virus de hepatitis C (VHC) negativos, y sin antecedentes de vacunación con BCG. Los participantes que cumplieron con todos los criterios de elegibilidad fueron aleatorizados 1:1 en dos grupos de tratamiento. Las inyecciones del estudio se realizaron los días 0 y 56 del estudio. La seguridad general se evaluó los días 0, 7, 56, 63 y 84 para cada participante. Se evaluó la sangre para análisis de laboratorio de seguridad (hematología y química sérica) el día de la selección y en los días de estudio 7 y 63. Todos los participantes completaron una ayuda de memoria escrita para participantes que solicitaba reacciones adversas locales y sistémicas durante los 7 días posteriores a cada inyección del estudio. Los AA no solicitados se registraron hasta el día 84 del estudio (28 días después de la última inyección del estudio). La aparición de SAE y la aparición de cualquier PIMMC se registraron durante todo el período de estudio (aproximadamente 421 días). La inmunogenicidad se evaluó el día del estudio 0 (antes de la dosis) y los días del estudio 7, 14, 56, 63, 70, 84 y 224. Los participantes recibieron una compensación de $75 por visita del estudio y $10 por visita telefónica.

El tamaño de la muestra de 48 participantes se determinó por lo que es razonable para un ensayo de Fase 1 y permite solo información preliminar sobre seguridad e inmunogenicidad relevante para la progresión a ensayos más grandes. En base a la experiencia clínica previa con la presentación no termoestable de ID93 + GLA-SE, estimamos que un tamaño de muestra de 24 participantes por grupo permitiría detectar un aumento en la frecuencia de reacciones adversas sistémicas de >32,5 % en el grupo de presentación termoestable en comparación con el grupo de presentación no termoestable al 80 % de potencia con un intervalo de confianza unilateral del 95 %, y detección de una disminución en la tasa de respuesta de anticuerpos séricos de >10 % en el grupo de presentación termoestable en comparación con el grupo de presentación no termoestable al 90% de potencia con un intervalo de confianza unilateral del 95%. Este estudio incluyó a todos los adultos sanos que cumplieron con los criterios de inclusión/exclusión, independientemente del sexo. El sexo se determinó en base al autoinforme. No se realizaron análisis basados ​​en sexo o género ya que el estudio no fue diseñado con el poder suficiente para abordar adecuadamente este aspecto. Los criterios de valoración primarios incluyeron (1) la cantidad de participantes que experimentaron reacciones locales solicitadas en el lugar de la inyección dentro de los 7 días posteriores a cada inyección del estudio, (2) la cantidad de participantes que experimentaron reacciones sistémicas solicitadas dentro de los 7 días posteriores a cada inyección del estudio, (3) la cantidad de participantes que informaron espontáneamente EA desde el día 0 del estudio hasta el día 84 del estudio, y (4) número de SAE considerados relacionados con cualquiera de las inyecciones del estudio informados en cualquier momento durante el período del estudio. Los criterios de valoración secundarios incluyeron (1) proporción de participantes con al menos un aumento de 4 veces en las respuestas de anticuerpos IgG a ID93 en los días de estudio 14, 56, 70, 84 y 224 en relación con el valor inicial (día de estudio 0) según lo analizado por ELISA; (2) cambio medio desde el inicio en las respuestas de anticuerpos IgG a ID93 en los días de estudio 14, 56, 70, 84 y 224 en relación con el inicio (día de estudio 0) según lo analizado por ELISA; (3) el número de células secretoras de citocinas IFN-γ e IL-10 en muestras de PBMC en respuesta a ID93 en los días de estudio 14, 56, 70, 84 y 224 en relación con el valor inicial (día de estudio 0) según lo analizado por ELISpot; y (4) el porcentaje de células T CD4+ y CD8+ que producen dos o más citoquinas en respuesta a ID93 medido por ICS con citometría de flujo de PBMC en los días de estudio 0, 7, 14, 56, 63, 70, 84 y 224. Los criterios de valoración exploratorios incluyeron (1) respuestas de anticuerpos de subclase IgG a ID93 en los días de estudio 0, 14, 56, 70, 84 y 224; (2) inhibición neta del crecimiento intracelular de M. tuberculosis utilizando sangre completa en los días de estudio 0, 70 y 224; (3) respuestas de anticuerpos IgA a ID93 en secreciones mucosas (hisopos nasales y colecciones de lágrimas) medidas por ELISA en los días de estudio 0, 70 y 84; (4) número de células secretoras de anticuerpos en PBMC según lo analizado mediante ELISpot de células B de cultivo corto en los días de estudio 0, 7, 56 y 63; (5) el número de células B de memoria específicas de antígeno en PBMC según lo analizado mediante ELISpot de células B de cultivo prolongado en los días de estudio 0, 56, 84 y 224; y (6) el porcentaje de células Tfh y marcadores de localización de células T en PBMC medidos mediante citometría de flujo de inmunofenotipado en los días de estudio 0, 7, 14, 56, 63, 70, 84 y 224.

Los participantes se inscribieron mediante aleatorización en dos grupos de tratamiento de acuerdo con los siguientes pasos. Se mantuvo un registro maestro de todos los participantes examinados. En la selección, los participantes que firmaron el formulario de consentimiento informado y cumplieron con todos los criterios de inclusión y ninguno de exclusión fueron identificados como elegibles para participar en el estudio. A los participantes elegibles se les asignó un número de identificación secuencial cuando se presentaron en la clínica el día 0 del estudio. Los estadísticos de DF/Net Research (Seattle, WA) generaron la lista de asignaciones de tratamiento aleatorias y la incluyeron en el módulo de inscripción del Sistema interactivo de aleatorización web. (IWRS), que está integrado en el software DFexplore. El coordinador del estudio o la persona designada en el sitio clínico realizó la inscripción y la aleatorización mediante DFexplore. Se utilizó la aleatorización en bloques de tamaño apropiado para equilibrar la inscripción en una proporción de 1:1 en cada uno de los dos grupos. A una persona designada en el sitio del estudio se le proporcionó una clave de tratamiento, que vinculaba el código de tratamiento con la asignación real del tratamiento y se guardaba en un lugar seguro.

El estudio se realizó como un ensayo doble ciego. Los participantes, los investigadores, el personal del estudio que realizaba cualquier evaluación relacionada con el estudio después de la inyección del estudio y el personal de laboratorio que realizaba los ensayos inmunológicos no conocían la asignación del tratamiento. El esquema de aleatorización de DF/Net Research se proporcionó al personal del estudio sin enmascaramiento (es decir, los farmacéuticos del sitio que realizan las preparaciones del producto del estudio y los administradores del producto del estudio sin enmascaramiento).

ID93 es un antígeno de subunidad recombinante y GLA-SE es una emulsión de escualeno que contiene el agonista sintético del receptor 4 tipo Toll, glucopiranosil lípido A (GLA)8,27. Este fue el quinto ensayo clínico en el que se administró la vacuna ID93 + GLA-SE a participantes humanos, pero el primero para la presentación termoestable de un solo vial (NCT01599897, NCT01927159, NCT02465216, NCT02508376 y NCT03722472). Los resultados de un ensayo anterior informaron la selección de dosis (2 µg ID93 y 5 µg GLA-SE) y el calendario para este ensayo8. La presentación liofilizada termoestable de un solo vial de ID93 + GLA-SE se desarrolló y fabricó como se describió anteriormente, incluida la optimización del contenido de excipientes, la ingeniería del proceso de liofilización y el monitoreo integral de la estabilidad fisicoquímica y de potencia12,13. El ID93 + GLA-SE liofilizado termoestable de un solo vial se reconstituyó con agua estéril para inyección (WFI) antes de la administración. La presentación de dos viales no termoestables se preparó reconstituyendo la proteína ID93 liofilizada con WFI estéril y mezclando 1:1 v:v con GLA-SE líquido antes de la administración. Para la presentación de dos viales, ID93 fue fabricado por el Centro de Biocatálisis y Bioprocesamiento de la Universidad de Iowa (CBB, Coralville, IA), y la liofilización fue realizada por la Universidad de Iowa Pharmaceuticals (Iowa City, IA). Liquid GLA-SE fue fabricado por el Instituto de Investigación de Enfermedades Infecciosas (IDRI; Seattle, WA), ahora el Instituto de Acceso a la Salud Avanzada (AAHI). Para la presentación de un solo vial, los fármacos a granel ID93 y GLA-SE se fabricaron en CBB e IDRI, respectivamente, y el fármaco final se fabricó en Lyophilization Technology, Inc (Warminster, PA). Todos los productos de investigación fueron proporcionados al Investigador (Daniel F. Hoft en la Universidad de Saint Louis) por el Patrocinador (IDRI). Los viales de ID93 + GLA-SE, ID93 y GLA-SE se enviaron y almacenaron en el sitio de estudio a 2–8 °C; la temperatura durante el envío y el almacenamiento se controló continuamente. El centro de estudio proporcionó WFI estéril.

La preparación de la vacuna del estudio, incluidas las diluciones de la vacuna y la mezcla para los dos grupos de dosificación, fue realizada por el farmacéutico del sitio no cegado utilizando una técnica aséptica el mismo día de la administración de la vacuna del estudio, pero no más de 2 horas antes de la administración. Una vez reconstituida, la vacuna de ambos grupos de tratamiento (presentaciones de uno y dos viales) parecía idéntica. La persona designada asignada para administrar las inyecciones del estudio recibió una jeringa cargada etiquetada con el número de identificación del participante y los datos de identificación requeridos por el hospital. El tiempo de preparación y el tiempo de administración se anotaron en la documentación fuente. Todas las inyecciones del estudio tenían un volumen de 0,5 ml y se administraron por vía intramuscular en el deltoides del brazo no dominante.

Todas las muestras se recolectaron en el sitio de estudio, se registraron y rastrearon (Centro para el Desarrollo de Vacunas de la Universidad de Saint Louis en St. Louis, MO). Las muestras de seguridad se enviaron el mismo día de la recolección a Quest Diagnostics, anteriormente LabOne (Lenexa, KS), para su procesamiento. Las muestras de inmunología para los criterios de valoración secundarios y exploratorios se procesaron en la Universidad de Saint Louis. Las muestras de suero y PBMC de cada participante se almacenaron aquí hasta la finalización del estudio, momento en el cual las muestras se enviaron a Advanced Bioscience Laboratories (ABL Inc.; Rockville, MD) para ensayos y análisis en dos envíos separados para mitigar el riesgo de pérdida de muestras. debido a excursiones de temperatura. Las PBMC se enviaron utilizando transportadores secos cargados con nitrógeno líquido y las muestras de suero se enviaron en hielo seco.

Para el ensayo del tubo indicador de crecimiento de micobacterias (MGIT), se recogió sangre utilizando tubos de recogida de heparina sódica estériles. Para las pruebas de hematología de seguridad, la sangre se recogió en tubos con EDTA. Para obtener muestras de suero para la química de seguridad y el análisis de anticuerpos, se recolectó sangre usando tubos separadores de suero (SST). Para el análisis de anticuerpos, después de la centrifugación a 750–930 × g durante 10–15 min a temperatura ambiente, se recogió el sobrenadante. Las muestras de suero de ~500 µL cada una se dividieron (en dos viales primarios y dos de respaldo), se colocaron en cajas criogénicas de 9 × 9 preenfriadas, se congelaron inmediatamente a −70 °C ± 10 °C y se almacenaron en posición vertical a −70 °C ± 10 °C hasta el envío a ABL.

Para obtener muestras de PBMC, se recogió sangre en tubos CPT de 8 ml (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). Después de la centrifugación a 1800 × g durante 30 min a temperatura ambiente en una centrífuga de cabezal basculante de rotor horizontal, se aspiró el plasma y se recogió la capa de células del tubo con una pipeta y se transfirió a un tubo de centrífuga cónico. A continuación, las células se lavaron y se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Posteriormente, las muestras de PBMC se dividieron en alícuotas de 8 × 106 en 1 ml de medio de congelación (suero fetal bovino (FBS) que contenía un 10 % de dimetilsulfóxido (DMSO)) por criovial. Las PBMC se congelaron inmediatamente en recipientes CoolCell (Corning, Corning, NY) o Mr. Frosty (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) a -70 °C ± 10 °C. Los viales de PBMC de cada participante se distribuyeron en dos cajas criogénicas separadas (principal y de respaldo) preenfriadas de 9 × 9 en una posición vertical en un congelador, luego se trasladaron a un congelador criogénico de nitrógeno líquido o fase de vapor dentro de 1 semana, y se almacenaron allí hasta el envío a ABL.

Para la recolección de muestras nasales, se insertó el mismo hisopo PurFlock estéril (Puritan Medical Products, Guilford, ME) en cada cavidad nasal junto con el tabique nasal y se giró 360° en cada dirección esperando 5 s después de cada rotación antes de retirar el hisopo con cuidado. Después de tomar muestras de ambas fosas nasales, la punta del hisopo se colocó en 3 ml de tampón que contenía PBS de Dulbecco (DPBS) con ácido l-glutámico 5 mM y sacarosa al 10 % (pH 7,2) en un tubo de centrífuga de 15 ml. Se quitó el bastoncillo aplicador del hisopo, dejando el hisopo en el tubo. Las muestras de hisopos nasales se mantuvieron en hielo húmedo o en un refrigerador a 2–8 °C durante un máximo de 2 h hasta que se congelaron. Las muestras se congelaron a -70 °C ± 10 °C y se almacenaron a esta temperatura durante al menos 24 h pero no más de 1 mes hasta su procesamiento. El procesamiento de la muestra consistió en agitar el tubo con vórtex durante 1 minuto y luego presionar el hisopo contra el costado del tubo antes de retirarlo. Luego, la muestra restante se dividió en alícuotas en criotubos y se almacenó a -70 °C ± 10 °C hasta su análisis en la Universidad de Saint Louis.

Las muestras de lágrimas se recolectaron primero exprimiendo una cáscara de naranja directamente sobre el ojo del participante. Luego, el participante parpadeó varias veces hasta que se generaron lágrimas. Las lágrimas (volumen objetivo 125 µL) se recogieron usando un tubo capilar que drenaba en un microtubo de recolección con tapón de rosca. Luego, el ojo afectado se lavó con una solución de lavado de ojos y una solución comercial de gotas para los ojos. Las muestras de lágrimas se mantuvieron en hielo húmedo durante un máximo de 2 h antes de procesarlas mediante centrifugación a 20 000 × g durante 5 min a ~4 °C. El sobrenadante se recogió en alícuotas de 15 µl, se colocó en viales de almacenamiento de 0,5 ml y se almacenó a -70 °C ± 10 °C hasta su análisis en la Universidad de Saint Louis.

La aparición de todos los EA se registró hasta el día de estudio 84, mientras que los SAE y los PIMMC se monitorearon hasta el día de estudio 421. Los EA se clasificaron por gravedad (es decir, grados 1, 2 o 3) y por relación con la inyección del estudio (es decir, no , posible, probable o definitivamente relacionado) de acuerdo con las definiciones proporcionadas en el Protocolo del estudio (Información complementaria). A efectos de notificación, de conformidad con las directrices del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (NIAID), los EA definitivamente, probablemente y posiblemente relacionados se consideraron relacionados con la inyección del estudio. Los EA no relacionados se consideraron no relacionados. Un SAE se definió como cualquier EA que resultó en la muerte, se consideró potencialmente mortal, requirió hospitalización o prolongación de la hospitalización, resultó en una discapacidad/incapacidad persistente o significativa, o resultó en una anomalía congénita/defecto de nacimiento en la descendencia de un participante del estudio. .

Las reacciones locales en el lugar de la inyección se evaluaron el día de la inyección del estudio (antes de la inyección y 60 minutos después de la inyección) y durante 7 días después de la inyección del estudio clasificando el dolor, el eritema y la induración. Las reacciones sistémicas solicitadas se definieron como la aparición de dolor de cabeza, artralgia, escalofríos, pérdida de apetito, fiebre, fatiga y/o mialgia en los 7 días posteriores a cada inyección del estudio. Estos síntomas se caracterizaron como Grado 1 (leve), Grado 2 (moderado) o Grado 3 (grave). Se distribuyeron folletos de ayuda para la memoria a cada participante para recopilar información local y sistémica de EA que cubría el período de 7 días después de cada inyección del estudio. Todos los participantes recibieron instrucciones de registrar la temperatura oral y los signos y síntomas locales y generales en ayudas de memoria individuales en la noche del día de la inyección y aproximadamente a la misma hora todos los días durante los 6 días posteriores a las inyecciones del estudio. El eritema y la induración en el lugar de la inyección se midieron y clasificaron utilizando la herramienta de medición proporcionada. También se pidió a los participantes que registraran los medicamentos que tomaban. La ayuda para la memoria se trajo a la clínica en la visita programada 7 días después de cada inyección para su revisión y el personal de investigación del estudio la recogió los días 7 y 63 del estudio. La ayuda para la memoria era una herramienta para ayudar al investigador y/o a la persona designada a en una conversación con el participante sobre cualquier AA que pueda haber ocurrido después de las inyecciones.

Se evaluaron el pulso, la temperatura oral, la frecuencia respiratoria y la presión arterial sistólica y diastólica en los días de estudio 0, 7, 56, 63 y 84. Se realizaron pruebas de laboratorio de seguridad (hematología y bioquímica sérica) 7 días después de cada inyección. Los cambios en los signos vitales o los valores de las pruebas de laboratorio que alcanzaron el Grado 1 o un grado superior se registraron como AA. Se realizaron pruebas de embarazo en orina en la clínica del estudio utilizando una prueba comercial. En la selección se realizó serología para VIH, HBsAg, VHC y QuantiFERON-TB Gold. Se realizaron pruebas de laboratorio de seguimiento no programadas a discreción del médico del estudio. Todas las pruebas de serología, hematología y química se realizaron en Quest Diagnostics.

Este ensayo clínico utilizó un Comité de Monitoreo de Seguridad (SMC) para monitorear la seguridad de los sujetos y estudiar los criterios de detención. El SMC se reunió 1 año después del inicio del ensayo para revisar el estado actual del estudio y discutir el informe resumido de seguridad hasta la fecha. No se identificaron problemas de seguridad significativos en ese momento. Por lo tanto, el SMC recomendó que el estudio procediera según lo planeado sin cambios.

Todas las evaluaciones de inmunogenicidad en muestras de suero y PBMC fueron realizadas por ABL. Los ELISA de suero se realizaron utilizando placas ELISA de 384 pocillos de alta unión recubiertas durante 2 h a temperatura ambiente con ID93 purificado o proteínas de subunidades (RV1813, RV2608, RV3619 o RV3620), cada una a 1 µg por ml. A continuación, las placas se lavaron tres veces con el tampón de lavado A (Teknova, Hollister, CA) y se bloquearon durante 4 h a temperatura ambiente con tampón de bloqueo (albúmina de suero bovino [BSA] al 1 % p/v y polisorbato 20 al 0,05 % p/v en PBS). ). A continuación, se descartó el tampón de bloqueo y se añadieron muestras a cada pocillo. El suero de control se diluyó cuatro veces, comenzando con una dilución inicial de 1:100 en BSA al 0,1 % con polisorbato 20 al 0,05 % en PBS, se añadió a los pocillos apropiados y se incubó durante la noche a 4 oC. Luego, las placas se lavaron siete veces antes de agregar anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) (consulte las Notas complementarias para diluciones y anticuerpos específicos) a los pocillos apropiados de acuerdo con el ELISA específico que se estaba realizando y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego, las placas se lavaron siete veces, se revelaron colorimétricamente agregando sustrato de peroxidasa SureBlue TMB (Kirkegaard & Perry Laboratories [KPL], Gaithersburg, MD), se incubaron durante ~ 10 min a temperatura ambiente y se detuvieron usando ácido sulfúrico 1 N. Las densidades ópticas (DO) se cuantificaron a 450 y 570 nm utilizando un lector de placas (Molecular Devices). Los datos de OD sustraídos (450–570 nm) se utilizaron para realizar análisis de datos posteriores. Los títulos de punto final se calcularon realizando un ajuste de mínimos cuadrados de los valores de OD en cada dilución a una curva sigmoidea de mínimos cuadrados de cuatro parámetros. Los valores de corte se calcularon como el promedio de los sueros de control negativo en todas las diluciones más seis o tres veces la desviación estándar según el isotipo del anticuerpo. A las muestras con valores de DO inferiores al límite se les asignó un título de punto final de 1,699, lo que representa la transformación logarítmica de 0,5 veces la dilución más baja.

Los ELISA secretores de inmunoglobulina A (sIgA) se realizaron con un hisopo nasal y muestras de lágrimas recolectadas en los días de estudio 0, 70 y 22428. Para el ELISA de sIgA específico de antígeno, las placas Immulon 2 se recubrieron con 1 µg por ml de proteína ID93 purificada (AAHI , Seattle, WA) diluido en PBS e incubado durante la noche a 4 °C, 5 % de CO2. A continuación, las placas se lavaron con PBS más polisorbato 20 al 0,05 % y se bloquearon con BSA al 1 % en PBS durante ~1 hora a 37 °C. Después del bloqueo, las placas se lavaron, las muestras de hisopos nasales y lágrimas se agregaron a pocillos duplicados en diluciones óptimas predeterminadas para cada tipo de muestra, y las placas se incubaron durante la noche a 4 °C. A continuación, las placas se lavaron con PBS más polisorbato 20 al 0,05 % y, con la adición de anti-IgA humana de cabra purificada conjugada con biotina (Cat# 5260-0027, KPL, Seracare Life Sciences) a una dilución de 500 veces, se incubaron durante 1,5 h. a temperatura ambiente protegido de la luz. Después de la incubación, las placas se lavaron con PBS más polisorbato 20 al 0,05 %, se añadió estreptavidina marcada con fosfatasa (KPL) y las placas se incubaron durante 1,5 h a temperatura ambiente, protegidas de la luz. Al final de la incubación, se preparó la solución de sustrato pNPP (SIGMAFAST p-Nytrophenyl fosfato Tablets, MilliporeSigma), luego las placas se lavaron con PBS más polisorbato 20 al 0,05 % y se agregó la solución de sustrato. Las placas con solución de sustrato se incubaron durante 50 min (a temperatura ambiente y protegidas de la luz), se añadió solución de parada AP (KPL) y se leyó la absorbancia a 405/550 de doble longitud de onda. El ELISA sIgA total se realizó siguiendo el protocolo del kit ELISA IgA (humano) (Abnova, Taipei, Taiwán; #KA2110).

La ICS se realizó de acuerdo con los siguientes procedimientos. Las PBMC de los participantes del estudio se descongelaron y reposaron en medios R10 (RPMI 1640 con 10 % de FBS, 1 % de l-glutamina y 1 % de penicilina-estreptavidina) a una concentración máxima de 2 × 106 células por ml durante la noche a 37 °C y 5 % CO2. Luego, las PBMC se resuspendieron a una concentración de 10 × 106 células por ml y se distribuyeron de manera que 1 × 106 células por ml se estimularon cada una con 0,25 μg por ml de enterotoxina estafilocócica B (SEB) o 10 μg por ml de ID93 o 0,3 % de DMSO, y también se añadió a cada uno un cóctel de coestimulación CD28/CD49d. Después de incubar las PBMC durante 2 horas a 37 °C y CO2 al 5 %, se añadió brefeldina A 1X para retener las proteínas secretoras (p. ej., citoquinas e interleucinas) intracelularmente. La activación continuó durante 10 h adicionales a 37 °C y 5 % de CO2 con las células incubadas en una bolsa de plástico sellada que contenía una toalla húmeda. Los recuentos de células y el porcentaje de viabilidad se monitorearon utilizando el citómetro de flujo Guava EasyCyte (Luminex, Austin, TX). A continuación, las células se tiñeron en múltiples etapas para detectar objetivos divididos en regiones/zonas. Las células se tiñeron por separado: primero con una dilución de 500 veces de colorante de viabilidad (CD14 humano BV510, Cat# 301842, BioLegend) durante 20 min a temperatura ambiente seguido de 5 µg por ml de bloque Fc humano durante 10 min a temperatura ambiente (protegido de luz), y luego con un cóctel marcador de superficie extracelular durante 20 min a temperatura ambiente. Una lista completa de anticuerpos y diluciones y otros reactivos utilizados se encuentran en las Notas complementarias. A continuación, las células se permeabilizaron y se fijaron con BD CytoFix/CytoPerm (BD Biosciences) durante 10 min a temperatura ambiente (protegidas de la luz), seguido de lavados con tampón 1X Perm/Wash. Finalmente, las células se tiñeron con un cóctel de marcadores intracelulares durante 30 min a temperatura ambiente (protegidas de la luz), se fijaron con fijador estabilizador BD 1X durante 20 min a temperatura ambiente y se analizaron dentro de las 16 h posteriores a la tinción en el citómetro de flujo BD LSRFortessa. Los datos sobre los recuentos y las frecuencias de la población celular se recopilaron utilizando el software FlowJo v10.8.1 (BD Biosciences).

Se realizó un ensayo ELISpot de células B a corto plazo para detectar la frecuencia de células secretoras de anticuerpos circulantes. Las placas se activaron con alcohol al 35 %, cubriendo los pozos apropiados con antígeno de captura ID93 o anticuerpo de captura IgG/IgA (Clon MT91/145, Cat# 3850-3-1000, o Clon MT57, Cat# 3860-3-1000, respectivamente, MabTech) a una dilución de 100 veces y se incubó durante la noche a 4 °C. A continuación, las placas se bloquearon utilizando medio R10. Las PBMC se descongelaron, se incubaron durante 2 horas a 37 °C y 5 % de CO2 y se contaron antes de sembrarlas en pocillos bloqueados (5 × 105 células por pocillo para ID93 o 1 × 105 células por pocillo para IgG/IgA). Las células se cultivaron durante 18–22 h a 37 °C y 5 % de CO2. A continuación, las placas se lavaron, se incubaron con anticuerpos de detección anti-IgG o anti-IgA (Clon MT78/145, Cat# 3850-6-250, o Clon MT20, Cat# 3860-6-250, respectivamente, MabTech) a 500 veces dilución durante 2 h a temperatura ambiente, lavado, incubado con anticuerpo secundario anti-biotina estreptavidina-fosfatasa alcalina (AP) (Cat# 3310-9-1000, MabTech) durante 1 h a temperatura ambiente, lavado y finalmente desarrollado usando nitro- tetrazolio azul/5-bromo-4-cloro-3'-indolifosfato (NBT/BCIP) durante 7 min a temperatura ambiente antes de parar con agua destilada. Dentro de los 2 días posteriores al desarrollo, las placas se escanearon, contaron y sometieron a control de calidad usando el analizador ImmunoSpot (Cellular Technology Limited, Cleveland, OH).

Se realizó un ensayo ELISpot de células B a largo plazo para detectar células B de memoria siguiendo los mismos procedimientos descritos anteriormente, excepto que las PBMC se cultivaron primero durante 3 días con medio R10 suplementado con resiquimod/IL-2 de células B policlonales B-Poly-S humanas. estimulador (Cellular Technology Limited) y luego en placa (2 × 105 células por pocillo para ID93 o 5 × 104 células por pocillo para IgG/IgA) y revelado en el cuarto y quinto día, respectivamente.

Los ensayos ELISpot de células T de IFN-γ e IL-10 se realizaron de acuerdo con los siguientes procedimientos. Las placas se activaron con alcohol al 35 % y se cubrieron con anticuerpos de captura para IFN-γ o IL-10 (clon 1-D1K, n.° de cat. 3420-3-250 o clon 9D7, n.° de cat. 3430-3-250, respectivamente). MabTech) a una dilución de 100 veces y se incubó durante la noche a 4 °C. Las PBMC de muestra de estudio y las PBMC de control de donantes de citomegalovirus, virus de Epstein-Barr, virus de la influenza y toxina tetánica (CEFT) se descongelaron, contaron e incubaron durante la noche a 37 °C y 5 % de CO2. Luego, las placas se bloquearon agregando medio R10 y se almacenaron durante 2 a 4 h a 37 °C y 5 % de CO2. Las muestras de estudio y las PBMC de control se volvieron a contar y se resuspendieron a las concentraciones apropiadas. Las células se sembraron en placas de fluoruro de polivinilideno (PVDF) de 96 pocillos según las siguientes densidades. Todas las muestras del estudio se sembraron a razón de 2 × 105 células por pocillo para ambos ensayos ELISpot de células T. Las PBMC de control de donantes se sembraron en 2 × 105 células por pocillo para la estimulación con fitohemaglutinina (PHA) (ensayo de IL-10) o 1 × 105 células por pocillo para la estimulación de CEF (ensayo de IFN-γ). Los estimulantes se agregaron a sus pozos correspondientes usando las siguientes concentraciones: 10 µg por mL ID93; 1 µg por ml de péptidos RV1813, RV2608, RV3619 o RV3620; 1–10 µg por ml de PHA; o 1 µg por ml CEF. Las placas ensambladas se incubaron durante la noche durante 18 a 22 h a 37 °C y 5 % de CO2. A continuación, las placas se lavaron y se incubaron con 1 µg por ml de anticuerpos de detección de IFN-γ antihumano o IL-10 antihumano (clon 7-B6-1, n.° de cat. 3420-6-250 o clon 12G8, n.° de cat. 3430). -6-250, respectivamente, MabTech) a una dilución de 1000 veces durante 2,5 horas a temperatura ambiente, se lavó, se incubó con estreptavidina-HRP durante 1 hora a temperatura ambiente, se lavó y finalmente se reveló con NovaRED (Vector Laboratories, Newark, CA) durante ~15 min a temperatura ambiente antes de parar con agua destilada. Dentro de 1 a 2 días posteriores al desarrollo, las placas se escanearon, contaron y sometieron a control de calidad utilizando el analizador ImmunoSpot.

La actividad micobactericida se estudió en cultivos de sangre total desde los días 0, 7 y 224 como se describió previamente29. Brevemente, se usó medio RPMI 1640 con L-glutamina y HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazina etanosulfónico) para diluir las muestras de sangre completa heparinizada, luego estas muestras de sangre completa diluida se agregaron en tubos de 2 ml con BCG (por duplicado) y bien tapado. Luego, los tubos se colocaron en un rotador y se rotaron continuamente durante 72 h a 37 °C. Después de la incubación, los tubos se centrifugaron a 13 000 × g durante 10 min y se eliminó el sobrenadante. El sedimento restante de cada tubo se resuspendió en medio (BD) de tubo indicador de crecimiento de micobacterias (MGIT) suplementado con PANTA, se agitó completamente y luego se transfirió a un MGIT fluorimétrico (BD). Los MGIT con muestras se taparon herméticamente y se colocaron en un instrumento Bactec MGIT 320 (BD). El tiempo de positividad (TTP) de MGIT se rastreó y registró automáticamente.

El análisis inmunológico se realizó con Prism 9.3 o superior (GraphPad Software, San Diego, CA), SAS 9.4 (SAS Institute, Cary, NC) o R 4.03 (The R Foundation, Viena, Austria). Los datos categóricos se analizaron mediante la prueba exacta de Fisher y un nivel de significancia de 0,05 (α = 0,05) con ajustes de Bonferroni cuando se realizaron comparaciones por pares entre más de dos categorías.

Los datos continuos se compararon entre dos grupos de tratamiento utilizando la prueba de suma de rangos de Wilcoxon, ya que la suposición de normalidad no se cumplió para ningún conjunto de datos según la prueba de Shapiro-Wilk. Las tasas de respuesta se compararon mediante la prueba exacta de Fisher. Las diferencias se detectaron con base en una prueba bilateral y p ≤ 0,05 (α = 0,05) con ajustes de Bonferroni siempre que se realizaron comparaciones por pares entre múltiples puntos de tiempo. Las comparaciones se acompañaron de la estimación puntual y el intervalo de confianza (IC) del 95% para cada grupo. Se asumió que los datos faltantes faltaban completamente al azar (MCAR), y se realizó un análisis de los datos disponibles.

Las respuestas de anticuerpos IgG (IgG, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 totales) al antígeno ID93 se midieron mediante ELISA utilizando suero recogido de un participante dado. En cada punto de tiempo, se informó el MEPT calculado a partir de duplicados. En cada punto de tiempo posterior a la inyección, se calculó la siguiente relación Post:Pre:

Se consideró que un participante respondía con anticuerpos positivos en un momento determinado si se cumplían los criterios de idoneidad del sistema para un ELISA determinado y la relación Post:Pre en ese momento era ≥4.

Las respuestas celulares a la proteína ID93 se evaluaron midiendo la producción de citocinas en PBMC mediante el ensayo ELISpot y mediante ICS con citometría de flujo. Se realizaron ensayos ELISpot de IFN-γ e IL-10 en muestras de los días de estudio 0, 14, 56, 70, 84 y 224 para determinar la proporción de PBMC que producen IFN-γ o IL-10 en respuesta a la estimulación con ID93 o sin estimulación. (PBS). Para el análisis, se calcularon los valores de las unidades formadoras de puntos (SFU) sustraídas del fondo. En cada punto de tiempo posterior a la inyección, el cambio desde la línea de base se calculó restando el valor SFU sustraído de fondo en la línea de base de un punto de tiempo dado. Se resumieron tanto las SFU sustraídas de fondo como el cambio desde la SFU inicial para cada participante y día de visita. El estado de respuesta en cada punto de tiempo se determinó mediante el modelo MIMOSA, un marco estadístico bayesiano que controla la tasa de descubrimiento falso al 0,1 %30. La configuración de la cadena de Markov Monte Carlo (MCMC) utilizó el hiperparámetro predeterminado. Específicamente, se asumió que las probabilidades tanto de respondedores como de no respondedores seguían la distribución beta donde los hiperparámetros recibieron valores previos exponenciales vagos con una media de 1000. Se asumió que la proporción desconocida de respondedores se extrajo de una distribución uniforme entre 0 y 1. Cada La ejecución de MCMC usó 200 000 iteraciones después de 50 000 iteraciones preliminares. Luego se calculó la tasa de respuesta en función del número total de participantes analizados dentro de cada grupo de tratamiento.

PBMC ICS se realizó en muestras de los días de estudio 0, 7, 14, 56, 63, 70, 84 y 224 para determinar la proporción de células T CD4 y CD8 multifuncionales y únicas que producen diversas combinaciones de IFNγ, TNF, IL- 2, IL-4, IL-21 y CD154 en respuesta a la estimulación con ID93. Se aplicó una puerta para cada marcador funcional, sin tener en cuenta la coexpresión de otros marcadores (Figuras complementarias 6-10). Más tarde se crearon puertas booleanas basadas en las puertas que se muestran para identificar celdas que expresan varias combinaciones de marcadores. Analizamos la población de células T en busca de dos o más citocinas, que fueran positivas para al menos dos marcadores inmunitarios entre IFN-γ, TNF, IL-2, IL-4, IL-21 y CD154. También evaluamos las células T que expresaban combinaciones seleccionadas de los seis marcadores inmunitarios. Todos los valores negativos de la sustracción de fondo se fijaron en cero. La frecuencia sustraída de fondo (%) se calculó como la frecuencia de células T positivas para citoquinas para las muestras estimuladas con ID93 menos las muestras no estimuladas (sustraída de fondo).

En cada punto de tiempo posterior a la inyección, el cambio desde la línea base se calculó restando la frecuencia sustraída de fondo (%) en la línea base de un punto de tiempo dado. Se resumieron tanto las frecuencias sustraídas de fondo como las de cambio con respecto a la línea de base para cada participante y día de visita. El estado de respuesta se determinó para cada participante, día de visita y subconjunto de células T utilizando el modelo MIMOSA. Luego se calculó la tasa de respuesta en función del número total de participantes analizados dentro de cada grupo de tratamiento.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable. Sin embargo, los datos de los participantes individuales no estarán disponibles porque el consentimiento informado no lo incluyó explícitamente. El protocolo del estudio, la disposición de los participantes del estudio y las desviaciones del protocolo se incluyen en la Información complementaria. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Los autores desean agradecer a los miembros del Comité de Monitoreo de Seguridad (W. Henry Boom, Fiona Smaill y Kathleen M. Neuzil), los Monitores de Seguridad Independientes (John Richart y Marie Philipneri) y el Monitor Médico (Stuart Kahn) por su excelente supervisión y retroalimentación. Los autores también desean agradecer a nuestros colegas de la División de Microbiología y Enfermedades Infecciosas/NIAID/Institutos Nacionales de Salud (NIH) por las discusiones útiles y comprometidas y la gestión de proyectos, incluidos Larry Wolfraim, Carol Ostrye, Onyinye Erondu, Mohamed M. Elsafy, Mamodikoe Makhene, Jonathan McInnis, Michelle Wildman y Kamal Velmurugan. Los autores también agradecen la gestión del proyecto y la asistencia administrativa de Prerana Ranjitkar, Elyse Beebe, Sandra Sivananthan, Elise Larson, Jannabeth Bannister y Tre Argerious; y asistencia editorial de Valerie Soza. Este trabajo fue apoyado por fondos federales de NIAID, NIH, Departamento de Salud y Servicios Humanos, bajo el Contrato #HHSN272201400041C (CBF). NIAID participó en el diseño del estudio, análisis y redacción del manuscrito.

Escucha Frevol

Dirección actual: HDT Bio, Seattle, WA, EE. UU.

Bridget pescador

Dirección actual: Bristol-Myers Squibb, Seattle, WA, EE. UU.

Día de Tracey

Dirección actual: Janssen Vaccines, Leiden, Países Bajos

julio vergara

Dirección actual: Universal Cells, Seattle, WA, EE. UU.

Acceso al Instituto de Salud Avanzada (anteriormente Instituto de Investigación de Enfermedades Infecciosas), Seattle, WA, EE. UU.

Zachary K. Sagawa, Cristina Goman, Aude Frevol, Bridget Fisher, Tracey Day, Raodoh Mohamath, Julie Vergara, Alan Lew, Anna Marie Beckmann, Corey Casper y Christopher B. Fox

Centro de la Universidad de Saint Louis para el Desarrollo de Vacunas, St. Louis, MO, EE. UU.

Azra Blazevic, Janice Tennant y Daniel F. Hoft

Laboratorios de biociencia avanzada (ABL), Inc., Rockville, MD, EE. UU.

Stephen Jackson, Franck Lemiale, Leon Toussaint e Irene Kalisz

DF/Net Research, Inc., Seattle, WA, EE. UU.

Joe Jiang y Lisa Ondrejcek

Departamento de Salud Global, Universidad de Washington, Seattle, WA, EE. UU.

Corey Casper y Christopher B. Fox

Departamento de Medicina, Universidad de Washington, Seattle, WA, EE. UU.

corey casper

División de Vacunas y Enfermedades Infecciosas, Fred Hutchinson Cancer Center, Seattle, WA, EE. UU.

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AMB, BF, CBF, CC, DFH, TD y ZKS concibieron el estudio. AL, AMB, CBF, DFH, FL, JT, LO y SJ supervisaron la investigación. AL, AMB, CBF, DFH, FL, JT y SJ administraron el proyecto. AMB, AB, DFH y RM proporcionaron recursos. CBF adquirió financiamiento. AMB, AF, AB, CBF, CC, CG, DFH, IK, JT, JV, LT, RM, SJ y ZKS contribuyeron a la investigación. AMB, AB, BF, CBF, DFH, JV, RM, SJ, TD y ZKS contribuyeron a la metodología. AF, AB, CBF, CG, SJ y ZKS seleccionaron los datos. CBF, JJ y LO analizaron los datos. CBF, JJ, LO y ZKS visualizaron los datos. CBF y ZKS escribieron el primer borrador del manuscrito. AF, AB, BF, CBF, CC, CG, DFH, FL, IK, JJ, LT, SJ, TD y ZKS revisaron y editaron el manuscrito.

Correspondencia a Christopher B. Fox.

CBF no declara intereses no financieros en competencia, pero sí los siguientes intereses financieros en competencia. CBF es co-inventor de patentes que reclaman prioridad para WO/2015/103167, formulaciones de vacunas de un solo vial, y WO/2013/119856, formulaciones adyuvantes mejoradas que comprenden agonistas de TLR4 y métodos para usarlas. Los autores restantes declaran no tener intereses contrapuestos.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Sagawa, ZK, Goman, C., Frevol, A. et al. Seguridad e inmunogenicidad de un candidato vacunal contra la tuberculosis termoestable ID93 + GLA-SE en adultos sanos. Nat Comun 14, 1138 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36789-2

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Recibido: 23 de diciembre de 2022

Aceptado: 16 febrero 2023

Publicado: 06 marzo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36789-2

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